不同補給水源的城市人工湖中異養菌耐藥性及耐藥菌種屬分布研究

梁杰，張崇淼，朱聰聰，姬智乙，張佩佩，蘇露馨

西安建筑科技大學，陜西省環境工程重點實驗室，西北水資源與環境生態教育部重點實驗室，西安 710055

人工湖作為現代城市的重要組成部分，不僅能增加水汽循環、調節區域氣候，而且其景觀娛樂功能也隨著人們生活水平的提高顯得愈發重要[1]。地表水因取用方便，水質穩定等優點，是人工湖的主要補給水源，但這對于缺水城市來說卻是沉重的負擔[2]。隨著水資源供需矛盾的日益加劇以及污水再生處理技術的日臻完善，再生水作為城市人工湖的補給水源逐漸受到青睞[3-4]。北京奧林匹克公園的龍形水系[5]、天津生態濕地公園[6]和昆明的翠湖[7]都是再生水應用于城市人工湖的典型代表。

近年來的研究發現，城市地表水體可能是細菌耐藥性傳播的重要媒介[8-9]。城市人工湖耐藥菌污染狀況不僅關系到生態環境，也在一定程度上影響著社會公眾的身體健康[10]。然而，目前我國在城市人工湖細菌耐藥性污染方面的研究還處于起步階段，污染特征和內在規律尚不甚清楚[11]。使用地表水和再生水作為補給水源，對人工湖的細菌耐藥特性以及耐藥菌多樣性會產生何種影響，是否會造成差異化的結果，這些問題都亟待闡明。

本研究選取分別以地表水和再生水補水的2處人工湖為研究對象，通過長期取樣檢測，系統考察了人工湖中總異養菌群對常見抗生素的耐藥狀況，并對分離菌株進行耐藥表型分析和種屬鑒定。以期揭示不同補給水源對人工湖中細菌耐藥性和耐藥菌種屬分布的影響，為城市水環境中細菌耐藥性傳播控制提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 水樣采集

選擇西安市的XQ湖和FQ湖為研究對象，這2處人工湖坐落于西安市主城區的2處公園內，具有景觀和娛樂功能。XQ湖水面積約1.0×105m2，平均水深2 m，地表水是其補水來源，FQ湖水面面積約4.0×104m2，平均水深1.5 m，使用再生水補水。2018年4—11月，對這2處人工湖逐月進行水樣采集。使用1 L水樣采集器在水面下大約0.5 m處采樣，每個人工湖設置5個采樣點，采集5 L混合水樣，置于預先滅菌的聚乙烯瓶中，在6 h內送回實驗室分析。

1.2 水質指標測定

1.3 異養菌和耐藥菌含量測定

使用濾膜法對水樣中的異養菌進行計數[13]。將水樣梯度稀釋后，真空抽濾通過0.45 μm孔徑的混合纖維素濾膜，將濾膜細菌截留面向上緊密貼在PCA培養平板上，30 ℃培養24 h，對菌落數量為20～200的培養平板進行菌落計數，每次檢測做2個平行樣。使用菌落數量的平均值計算出每100 mL水樣中的異養菌數量。根據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI 2017)標準[14]，在PCA平板中分別加入氨芐西林(AMP)、磺胺甲惡唑(SMZ)和四環素(TET)制備出AMP、SMZ和TET抗性平板，其中相應抗生素質量濃度分別為32、512和16 μg·mL-1。類似地，使用濾膜法測定水樣中的耐藥菌，計算得到水樣中AMP耐藥菌、SMZ耐藥菌和TET耐藥菌的含量。

1.4 菌株分離純化與耐藥表型檢測

隨機挑取PCA平板上的菌落，平板劃線進行分離純化。采用K-B紙片瓊脂擴散法對分離菌株進行藥敏試驗，使用游標卡尺測量抑菌環直徑，根據CLSI標準判定其是否為耐藥菌。3種藥敏紙片中的抗生素含量為：AMP，10 μg·片-1；SMZ，300 μg·片-1；TET，30 μg·片-1。使用大腸埃希氏菌ATCC25 922作為質控菌株。將分離所得的耐藥菌逐一編號，菌株編號上的“XQ”和“FQ”代表其來源人工湖。

1.5 菌株種屬鑒定

針對分離菌株中的耐藥菌，使用細菌基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，TaKaRa公司)提取總DNA。選擇通用引物27 F 5’-AGAGTTTGAT-CCTGGCTCAG-3’和1492 R 5’-GGTTACCTTGTT-ACGACTT-3’，以及516 F 5’-TGCCAGCAGCCG-CGGTA-3’和1510 R 5’-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3’，使用梯度PCR儀(Veriti型，美國Applied Biosystem公司)對16S rDNA進行PCR擴增[15-16]，反應程序：94 ℃預變性5 min；35個循環：94 ℃變性60 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s；72 ℃延伸5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳(JY300C型，北京君意東方電泳設備有限公司)初步判定，然后送交上海生工生物工程技術服務有限公司測序。使用BLAST對測序結果在GenBank數據庫中進行序列比對，確認其種屬。

1.6 統計分析

使用SPSS Statistics 18.0軟件對常規理化指標、總異養菌群含量、耐藥菌含量和分離出的耐藥菌比例進行均值比較、相關性分析。用MEGA 7軟件對耐藥菌株中的氣單胞菌屬進行聚類分析，構建進化樹。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 人工湖水體的常規理化指標

2.2 人工湖中總異養菌及耐藥菌含量

表1 XQ湖和FQ湖常規理化指標的t檢驗結果Table 1 The t-test results for conventional physical and chemical indicators in XQ Lake and FQ Lake

圖1 人工湖中總異養菌和耐藥菌含量注：AMP表示氨芐西林，SMZ表示磺胺甲惡唑，TET表示四環素。Fig. 1 Total heterotrophic bacteria and antibiotic-resistant bacteria concentration in artificial lakesNote: AMP stands for ampicillin; SMZ stands for sulfamethoxazole; TET stands for tetracycline.

2.3 分離菌株的耐藥表型

從XQ湖和FQ湖分別分離出61株和60株異養菌。藥敏試驗結果如表2所示，XQ湖中的AMP耐藥菌、SMZ耐藥菌和TET耐藥菌的數量分別為37、11和9；FQ湖中這3種耐藥菌的數量分別為42、11和5。顯然，這2處人工湖分離菌株中的AMP耐藥菌比例都較高(60.7%和70.0%)，而TET耐藥菌則占比較低(14.8%和8.3%)，這與2處人工湖總異養菌群中AMP耐藥菌和TET耐藥菌含量高低狀況基本吻合。對XQ湖和FQ湖每月分離出的3種耐藥菌株檢出率進行比較，未發現它們存在顯著性差異(P>0.05)。

根據化學結構和作用機制，AMP、SMZ和TET分別歸屬于β-內酰胺類、磺胺類和四環素類抗生素，它們的抗菌機制各不相同：AMP主要是抑制菌體細胞壁的合成，SMZ抑制細菌葉酸合成過程中的二氫蝶酸合酶，TET則是抑制細菌蛋白質合成，從而導致細菌無法生長繁殖[19]。從XQ湖和FQ湖共分離出84株耐藥菌，產生了5種耐藥表型。如表2所示，對AMP單一耐藥的占比高達71.4%，遠高于其他表型；其次為AMP-SMZ-TET，占比14.3%；AMP-SMZ和SMZ單一耐藥的占比都僅為6.0%；AMP-TET的最少，只有2.4%。由此可見，這2處人工湖中異養菌的耐藥表型比較集中，對AMP單一耐藥是其最主要的耐藥表型。

2.4 耐藥菌株的種屬鑒定

分離出的84株耐藥菌在生物分類學上歸屬于19個種。其中，XQ湖耐藥菌39株，12個種；FQ湖耐藥菌45株，12個種。蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)和鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultella ornithinolytica)是2個湖共有的耐藥菌(圖2)。

從XQ湖分離的AMP耐藥菌共有10個種，主要是蠟狀芽孢桿菌，占比為54.1%；SMZ耐藥菌和TET耐藥菌分別有8個種和5個種，主要種屬是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和大腸埃希氏菌。從FQ湖分離出的AMP耐藥菌有10個種，蠟狀芽孢桿菌仍是主要菌株，占比54.8%；SMZ耐藥菌和TET耐藥菌分別有8個種和4個種，主要為維氏氣單胞菌和大腸埃希氏菌。一些研究表明，從臨床和食物中分離出的蠟狀芽孢桿菌對β-內酰胺抗生素具有高度耐藥性[20]，但對其他多種抗生素都敏感[21]。這與本研究從人工湖中分離出的蠟狀芽孢桿菌的耐藥特性近似。

對照已知的固有耐藥菌譜[14]，可以發現從XQ湖和FQ湖中分離得到了一些對AMP的固有耐藥菌，包括肺炎克雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，但它們在分離菌株中的占比均不超過10%。這2處人工湖分離出的菌株中均不存在對SMZ或TET的固有耐藥菌。

結合上述耐藥性異養菌群測定結果分析可知，獲得性耐藥很可能是城市人工湖中細菌耐藥性的主要來源。很多研究都表明，人類活動對細菌耐藥性的傳播有重要貢獻，在污水、地表水，甚至飲用水中都發現了多種抗生素抗性基因[22-23]。此外，基因水平轉移(horizontal gene transfer, HGT)在微生物群落中普遍存在，胞內DNA和胞外DNA都在細菌間的耐藥性傳播中發揮著重要作用[24-25]。XQ湖的補給水源為地表水，其在輸送過程中流經村莊及農田時不可避免地會有耐藥菌和耐藥基因匯入，最終進入XQ湖；FQ湖的補給水源為再生水，其由城市污水經深度處理所得，亦含有數量可觀的耐藥菌和耐藥基因[26]。耐藥菌進入湖水后生長繁殖會增加這類耐藥菌的數量；耐藥基因的水平轉移會擴大耐藥菌的種屬分布范圍，二者都會導致人工湖總異養菌群耐藥率的提高。此外，在XQ湖和FQ湖中分離出的耐藥菌株中，大部分屬于條件致病菌，有些在臨床和環境樣品中都經常檢出，例如氣單胞菌、葡萄球菌等。這在一定程度上也反映了人類活動與環境之間的交互作用。

圖2 人工湖中分離的耐藥菌株種屬Fig. 2 Species of antibiotic-resistant strains isolated from artificial lakes

表2 XQ湖和FQ湖分離菌株的耐藥表型Table 2 Antibiotic resistance phenotypes of isolates strains from XQ Lake and FQ Lake

2.5 耐藥性氣單胞菌的聚類分析

氣單胞菌屬在環境中分布非常廣泛，是水環境中的主要耐藥菌群之一[27]。從XQ湖和FQ湖中共分離出16株耐藥性氣單胞菌，分別歸屬于維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)。通過聚類分析構建進化樹(圖3)，可以發現，大多數豚鼠氣單胞菌16S rDNA序列的相似性極高。相比嗜水氣單胞菌，維氏氣單胞菌與豚鼠氣單胞菌的關系更疏遠，分離出的維氏氣單胞菌在進化樹中的親緣關系也更為復雜。這些氣單胞菌中有10株僅對AMP耐藥，1株(FQ80901)僅對SMZ耐藥，5株(XQ81001、FQ81003、FQ81001、FQ81004和FQ80903)對AMP和SMZ二重耐藥。從進化樹來看，除了屬于豚鼠氣單胞菌的FQ80903之外，其余4株二重耐藥菌都是維氏氣單胞菌，處在相近的分支上。總體來看，維氏氣單胞菌耐藥譜較為多樣，而豚鼠氣單胞菌耐藥表型較單一。值得注意的是，本研究并未發現分離來源對這些耐藥性氣單胞菌的聚類有明顯影響，例如FQ80903、FQ80705、XQ81004和XQ805-2-01，盡管來自2處不同的人工湖，但它們在進化樹中都在同一分支；也沒有發現某種來源的氣單胞菌具有明顯的耐藥性聚類特征。

圖3 耐藥性氣單胞菌屬進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of antibiotic-resistant Aeromonas

綜上所述：

(1)XQ湖和FQ湖中AMP耐藥菌、SMZ耐藥菌含量約為102～104CFU·(100 mL)-1，TET耐藥菌含量約為101～103CFU·(100 mL)-1。2個湖共分離出84株耐藥菌，71.4%都是對AMP單一耐藥。蠟狀芽孢桿菌是主要的AMP耐藥菌。

(2)從XQ湖和FQ湖分離出的耐藥菌歸屬于19個種，其中蠟狀芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和鳥氨酸拉烏爾菌為2個湖共有耐藥菌。僅有不足10%的細菌對AMP具有固有耐藥性，沒有發現對SMZ和TET具有固有耐藥性的菌種。獲得性耐藥很可能是城市人工湖中細菌耐藥性的主要來源。

(3)地表水補水的XQ湖和再生水補水的FQ湖在總異養菌含量、耐藥菌含量和檢出率上均無顯著差異。進化樹分析結果表明，分離來源對16株耐藥性氣單胞菌的聚類并無明顯影響。