連錢草活性成分的濁點萃取工藝優化

周子軒 謝建開 季澤濤 申奧 黃菊

摘? ?要：為優化濁點萃取法提取連錢草中活性成分的工藝條件，以提取液對DPPH自由基清除率為指標，采用單因素實驗預先確定各因素的適宜水平，再進一步利用正交實驗確定最優工藝條件。實驗結果表明，當料液比為1∶35，平衡時間為60 min，離子濃度為0.7 mol/L，表面活性劑質量濃度為50 g/L時，連錢草活性成分的提取率最大，對DPPH自由基清除率為88.22%。

關鍵詞：濁點萃取;活性成分;連錢草;正交實驗

連錢草屬于唇形科活血丹屬，分布區域廣泛，在全國各地都很常見。作為中醫主要藥材，通常用于民間醫學治療高尿酸血癥、風濕病、痛風、腎炎、腎結石、尿道炎和膀胱炎。從連錢草中提取得到的化學成分主要是黃酮及其苷類、萜類化合物[1]。目前，常用的天然植物提取方法包括水提法、有機溶劑提取以及超臨界萃取等，但各自都存在一定的缺點，如耗時長、污染環境等，尤其是當今社會對低污染的需求越來越大、重視程度越來越高，因此，選擇一種簡單、高效、環境友好的提取方法對連錢草的進一步開發應用具有重要的現實意義[2-3]。

濁點萃取法是近年來出現的一種新興的液-液萃取技術，以中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點現象為基礎，改變實驗參數引發相分離，將疏水性物質與親水性物質分離[4-5]。具有操作簡單、提取率高、活性成分在提取過程中不易變性、不使用揮發性有機溶劑和環境友好等特點，本實驗選用TritionX-110為表面活性劑進行濁點萃取，通過正交實驗法優化提取工藝參數，考察表面活性劑質量濃度、料液比、離子強度、溫度和平衡時間等對提取效果的影響，從而獲得連錢草活性成分提取的最佳工藝條件。

1? ? 實驗部分

1.1? 實驗儀器和試劑

1.1.1? 儀器

離心機H1850，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;紫外可見分光光度計T6，北京普析通用儀器有限責任公司;超聲波清洗機JP-040S，深圳市潔盟清洗設備有限公司;電子天平JA2003，上海方瑞儀器有限公司;鼓風干燥箱DHG-9070A，蘇州江東精密儀器有限公司。

1.1.2? 試劑

聚乙二醇鋅基苯基醚（TritionX-110），阿拉丁試劑公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），美國Sigma公司;無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉和水楊酸等均為國產分析純。

1.2? 實驗方法

1.2.1 連錢草活性成分提取

連錢草烘干粉碎后過60目篩，稱取1 g粉末樣品，加入TritionX-110水溶液按一定料液比混合均勻，超聲30 min后放入高速離心機（8 000 r/s）中離心30 min，上層液體轉移至錐形瓶，加入適量氯化鈉，置于45 ℃水浴鍋中，出現分層，提取油性部分，加入15 mL無水乙醇，充分震蕩后放入離心機中離心5 min（6 000 r/s），上層液體倒入容量瓶中定容，待測。

1.2.2? DPPH自由基清除率測定

將連錢草活性成分提取液稀釋成最佳樣品質量濃度，用移液槍準確獲得待測樣品液2 mL，吸取濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液6 mL，轉到試管中，充分震蕩，在暗室低溫情況下靜放50 min，無水乙醇作參比液，通過紫外-可見分光光度計在517 nm波長處測定其吸光度值為A1;把2 mL的無水乙醇加入到6 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液中，并測得其吸光度值為A0，把2 mL的無水乙醇加入到6 mL的待測樣品液中，測得其吸光度值為A2。DPPH自由基清除率（S）計算公式為：

S=

1.2.3? 單因素實驗

選取對連錢草活性成分提取率影響較大的4個因素：料液比（表面活性劑溶液體積與連錢草粉末質量之比，mL/g）、離子強度（氯化鈉的濃度，mol/L）、平衡時間（min）、表面活性劑質量濃度（g/L），進行單因素實驗從而確定各因素的適宜水平。

1.2.4? 正交實驗

根據單因素實驗結果，每個因素選取3個水平進行正交實驗，如表1所示。

2? ? 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1? 平衡時間對DPPH清除率的影響

如圖1所示，當平衡時間增加時，連錢草活性成分提取液的DPPH清除率急劇上升，從40 min開始出現不同程度的下降。因此，選定最優平衡時間為40 min。

2.1.2? 料液比對清除率的影響

由圖2可知，當料液比從1∶15到1∶55時，提取液的DPPH清除率先上升而后下降，在1∶35時達到峰值。這是因為隨著液料比增大，提取溶劑越多，活性成分提取率就越大，這就使DPPH清除率提高，所以，濁點萃取的最優料液比為1∶35。

2.1.3? 離子濃度對清除率的影響

由圖3可知，當溶液的離子濃度從0.5 mol/L提高到0.6 mol/L時，連錢草活性成分提取液的DPPH清除率上升得非常快，而當離子濃度超過0.6 mol/L時，清除率便開始緩慢下降。這是由于TritionX-110的聚集數隨著離子強度的增加而增加，TritionX-110對連錢草活性成分的增溶能力得到提高。同時，加入NaCl能改變非離子表面活性劑的濁點溫度。但是，如果NaCl溶液的濃度不斷地提高，溶液濃縮系數會不斷上升，當達到一定值時，會導致萃取效率變化不明顯，此時，NaCl濃度的影響就不大，同時，考慮到成本的節約以及回收資源的問題，最終選定NaCl濃度為0.6 mol/L。

2.1.4? 表面活性劑質量濃度對活性成分提取效率的影響

由圖4可知，當表面活性劑質量濃度從20 g/L增加到40 g/L時，提取液的清除率都可達到一個較高的值。當表面活性劑質量濃度從40 g/L升到50 g/L時，對DPPH清除率下降。而當質量濃度超過50 g/L時，又出現上升趨勢，產生這種現象的原因可能是當表面活性劑質量濃度達到一定值時，隨著其質量濃度的增長出現增溶等問題。因此，TritionX-110的最佳質量濃度為30 g/L。

2.2? 正交實驗結果

連錢草活性成分提取液的DPPH清除率正交實驗結果如表2所示。

對正交實驗結果進行極差分析可知，料液比對連錢草活性成分提取物DPPH清除率的影響最大，平衡時間對清除率的影響緊隨其后，影響最小的是離子濃度。因此可得，影響連錢草活性成分提取物DPPH清除率的先后順序為B>A>D>C，即料液比>平衡時間>表面活性劑的質量濃度>離子濃度。分析k值可知，濁點萃取連錢草活性成分的最優工藝條件為A3B2C2D3，即平衡時間60 min，料液比1∶35，離子濃度0.7 mol/L，表面活性劑（TritionX-110）的質量濃度50 g/L。

按照最優實驗條件，進行3組平行實驗，將提取液稀釋至40 g/L，通過使用紫外-可見分光光度計測量各組的DPPH清除率，分別為84.30%、88.73%和87.64%，其平均值為86.89%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為2.66%。可以確定此濁點萃取工藝可行。

3? ? 結語

利用濁點萃取工藝提取連錢草中的活性成分，以對DPPH自由基清除率為考察指標，通過單因素和正交實驗優化了連錢草活性成分提取的最優條件。

（1）各個因素對提取效率的影響強弱順序是：料液比>平衡時間>表面活性劑質量濃度>離子濃度。連錢草活性成分的最優提取工藝是：料液比1∶35，平衡時間60 min，表面活性劑質量濃度50 g/L，離子濃度0.7 mol/L。驗證性實驗得出其清除率平均值為86.89%，相對標準偏差RSD為2.66%，在標準偏差之內。

（2）濁點萃取法用于連錢草活性成分的提取是一種行之有效的方法，黃酮類活性成分可以被表面活性劑有效萃取，實驗以純水為提取劑，不使用有機溶劑等揮發性物質，成本低、無污染，后續實驗可進一步表征提取物的化學成分和結構。

[參考文獻]

[1]劉曉鵬，張俊霞，姜? ?寧，等.響應面試驗優化超聲輔助提取連錢草多糖工藝及其體外抗氧化活性[J].食品科學，2016，37（4）：13-19.

[2]姜? ?寧，劉曉鵬，丁峰峻，等.微波輔助提取連錢草總黃酮的研究[J].河南農業科學，2015，44（4）：169-172.

[3]劉? ?學，曹瑩粲，韓王康，等.濁點萃取法提取黑種草子粕抗氧化劑的工藝研究[J].日用化學工業，2014，44（11）：624-627.

[4]MADEJ K，PERSONA K.Drug screening in human plasma by cloud-point extraction and HPLC[J].Central European Journal of Chemistry，2013，11（1）：94-100.

[5]STEFANOVA T S，SIMITCHIEV K K，GAVAZOV K B.Liquid-liquid extraction and cloud point extraction for spectrophotometric determination of vanadium using 4-（2-pyridylazo）resorcinol[J].Chemical Papers，2015，69（4）：495-503.