氧化苦參堿對(duì)骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

馬成龍,陳建平,李 航,羅 偉,孫倩倩,孫宇睿,馮曉月,蘇 睿

(1山西醫(yī)科大學(xué)麻醉教研室,太原 030001;2山西白求恩醫(yī)院,山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院疼痛科;*通訊作者,E-mail:sxcjp2011@163.com)

骨癌是某些原發(fā)于骨組織以外的惡性腫瘤(如乳癌、肺癌、腎癌、直腸癌等)經(jīng)血行轉(zhuǎn)移至骨組織引起的疾病,以骨損害、疼痛為主要臨床表現(xiàn)。骨癌引起的疼痛是癌癥最可怕的后果,極大地降低了患者的生活質(zhì)量[1]。目前藥物干預(yù)仍是治療骨癌痛的首選治療方案,阿片類(lèi)藥物被廣泛應(yīng)用于骨癌痛治療,雖然其鎮(zhèn)痛效果較好,但是持續(xù)治療導(dǎo)致的藥物耐受,以及長(zhǎng)期使用產(chǎn)生的嚴(yán)重不良反應(yīng)限制了其臨床的應(yīng)用[2]。由于中藥或天然藥物具有毒副作用小、機(jī)體不易殘留且鎮(zhèn)痛效果好等優(yōu)點(diǎn)引起了臨床醫(yī)生及科研人員的廣泛關(guān)注,因此尋求一種安全有效易得的天然藥物用于緩解骨癌痛患者的疼痛是目前該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)是從豆科槐屬植物苦參(SophoraflavescensAit)中提取的具有四環(huán)喹嗪啶類(lèi)結(jié)構(gòu)的生物堿類(lèi)成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,氧化苦參堿具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗纖維化及抗腫瘤等作用[3]。有研究表明氧化苦參堿可通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)改善慢性神經(jīng)性疼痛小鼠的坐骨神經(jīng)功能[4]。但是氧化苦參堿對(duì)轉(zhuǎn)移性骨腫瘤引起的骨癌痛是否具有抑制作用,目前尚未見(jiàn)報(bào)道。Toll樣受體4(TLR4)是機(jī)體免疫細(xì)胞中大量表達(dá)的受體,TLR4可激活其下游靶點(diǎn)NF-κB,誘導(dǎo)NF-κB的磷酸化并促進(jìn)IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的釋放,從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。有研究表明,催產(chǎn)素可通過(guò)抑制大鼠脊髓中的TLR4和促炎因子來(lái)緩解骨癌疼痛[5]。說(shuō)明TLR4/NF-κB信號(hào)通路在骨癌痛發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。因此,本研究構(gòu)建骨癌痛大鼠模型,觀察氧化苦參堿對(duì)骨癌痛大鼠模型的鎮(zhèn)痛作用并從TLR4/NF-κB信號(hào)通路角度探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司購(gòu)進(jìn)SPF級(jí)SD雌性大鼠(體質(zhì)量80-85 g)24只及同周齡同批次的SD雄性大鼠(體質(zhì)量180-220 g)50只,合格證號(hào):SCXK(遼)2010-001。購(gòu)進(jìn)的大鼠被飼養(yǎng)在符合SPF級(jí)的大鼠獨(dú)立送風(fēng)隔離籠(Individually Ventilated Cages,IVC)中,溫度(22±2)℃,相對(duì)濕度(60±5)%,亮 ∶暗循環(huán)比為12 h ∶12 h,每籠4只大鼠,可自由取用飼料和水。所有本研究中使用的實(shí)驗(yàn)方案得到了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器

氧化苦參堿購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;鹽酸曲馬多購(gòu)自北京四環(huán)醫(yī)藥科技股份有限公司;大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;RPMI Medium 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司;青-鏈霉素(penicillin-strepotomycin,P/S)購(gòu)自Thermo公司;小鼠抗GFAP、兔抗TLR4、IκB、p-IκB、NF-κB、p-NF-κB及GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記驢抗兔IgG購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;蛋白提取試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。大鼠IVC獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具(北京佳源興業(yè)科技有限公司);von Frey hairs(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱和超低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);X光機(jī)(Siemens AG Medical Solutions Group);倒置熒光生物顯微鏡(德國(guó)Leica公司);電動(dòng)勻漿器(上海季諾公司);Western blot電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(南京德鐵公司)。

1.3 Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)

Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞(上海中喬新舟生物有限公司)培養(yǎng)于含有10%FBS、1% P/S的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)到90%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并以2×107個(gè)/ml的密度保存于凍存管中備用。

1.4 骨癌痛大鼠模型的制備、分組及給藥

參照文獻(xiàn)[6]所述方法建立大鼠骨癌痛模型。取1.3中1 ml Walker256細(xì)胞,注射到體質(zhì)量為80-85 g的SD雌性大鼠腹腔中,注射后放回鼠籠中培養(yǎng)。7-9 d后觀察到SD雌鼠腹部明顯腫大,脫頸處死大鼠并抽取腹水于5 ml離心管中,以1 000 r/min離心5 min,棄去上清液,沉淀物用RPMI 1640培養(yǎng)基清洗3次,重新計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至1×108個(gè)/ml,置于冰盒內(nèi)備用。將50只SD雄性大鼠腹腔注射4%水合氯醛(0.7 ml/kg)麻醉后,左側(cè)膝關(guān)節(jié)部位去毛,暴露脛骨骨面,用牙科鉆頭在膝關(guān)節(jié)髕韌帶內(nèi)側(cè)緣沿脛骨縱軸往脛骨遠(yuǎn)端鉆孔,用微量移液器抽取腫瘤細(xì)胞20 μl,緩緩注射于鉆孔中,另取10只注射20 μl無(wú)菌生理鹽水作為假手術(shù)對(duì)照組(sham)。注射完成后固定15-20 s,然后緩慢拔出,最后用醫(yī)用骨蠟封好鉆孔。使用酒精棉球消毒并擦去溢出的Walker256細(xì)胞液,逐層縫合,并肌注青霉素鈉防止感染。術(shù)后7 d將Walker256細(xì)胞液注射大鼠分為骨癌痛模型組、鹽酸曲馬多陽(yáng)性藥組(Tramadol,腹腔注射10 μg/kg,連續(xù)7 d)、氧化苦參堿低、高劑量組(腹腔注射50,100 mg/kg,連續(xù)7 d),每組10只。

1.5 X攝片觀測(cè)各組大鼠脛骨病理學(xué)改變

術(shù)后第7天取假手術(shù)組和模型組大鼠4%水合氯醛麻醉后以仰臥位固定,用X光機(jī)拍攝每只大鼠股骨X線片,觀察脛骨病理學(xué)改變確認(rèn)模型構(gòu)建成功。

1.6 機(jī)械性縮足反射閾值的測(cè)定

將各組大鼠置于透明的金屬網(wǎng)格籠中,測(cè)定前使之適應(yīng)15-30 min,直至探覓行為停止后開(kāi)始測(cè)量。機(jī)械痛閾的行為學(xué)測(cè)定指標(biāo)為100%爪縮閾值(paw withdrawal threshold,PWT),采用Up and Down法對(duì)各組大鼠術(shù)前1 d及術(shù)后7,9,11,14 d的機(jī)械縮足反射閾值進(jìn)行測(cè)定,測(cè)試工具為纖毛機(jī)械刺激針(von Frey hairs)。Up and Down法操作方法為測(cè)定力度先從2 g開(kāi)始,當(dāng)該力度的刺激不能引起大鼠縮足反應(yīng)時(shí),則給予相鄰大一級(jí)力度的刺激;若出現(xiàn)縮足反應(yīng)則給予相鄰小一級(jí)力度的刺激,如此連續(xù)進(jìn)行,直至出現(xiàn)第一次陽(yáng)性和陰性反應(yīng)的騎跨,再連續(xù)測(cè)定4次取平均值。最大力度為15 g,大于此值時(shí)記為15 g。每次刺激間隔30 s。

1.7 組織取材與處理

行為學(xué)測(cè)定后處死各組大鼠,冰上快速取每只大鼠左側(cè)L4-6背根神經(jīng)節(jié)(DRG)標(biāo)本。將每組一半的DRG標(biāo)本保存于4%多聚甲醛中室溫固定過(guò)夜,進(jìn)行免疫熒光染色。另一半大鼠DRG組織快速放入液氮后,提取各組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)DRG組織的總RNA和蛋白。

1.8 免疫熒光檢測(cè)各組大鼠DRG中星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化

將放入4%多聚甲醛中固定過(guò)夜的DRG組織包埋在組織包埋盒中置于-80 ℃冰箱中凍實(shí),后置于-20 ℃冰凍切片機(jī)中做連續(xù)冠狀切片,片厚5 μm,隔10取1用于免疫熒光染色。4%多聚甲醛固定30 min,1%PBS洗滌3次,每次5 min;0.5% Triton X-100透化30 min,1×PBS洗滌3次,每次5 min;滴加適量5% BSA溶液封閉30 min;滴加小鼠抗GFAP一抗稀釋液(1 ∶300比例稀釋),4 ℃孵育過(guò)夜;1×PBS洗滌3次,每次5 min;滴加Cy3熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗稀釋液(1 ∶500)室溫避光孵育1 h,1×PBS洗滌3次,每次5 min;加入DAPI染色液(1 ∶500)避光反應(yīng)10 min,1×PBS洗滌3次,每次5 min;加適量抗熒光淬滅劑封片,倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 ELISA法檢測(cè)各組大鼠DRG中TNF-α、IL-1β和IL-6水平

稱(chēng)取各組大鼠DRG組織0.02 mg,用9倍體積(0.18 ml)的生理鹽水用電動(dòng)勻漿器勻漿成勻漿液,并置于1.5 ml離心管收集起來(lái)。采用ELISA試劑盒檢測(cè)各組大鼠DRG勻漿液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.10 Western blot法檢測(cè)各組大鼠DRG中TLR4/NF-κB信號(hào)通路中TLR4、IκB、p-IκB、NF-κB、p-NF-κB蛋白的表達(dá)

各組大鼠DRG中加入蛋白裂解液和終濃度為1 mmol/L的PMSF并置于電動(dòng)勻漿器中勻漿,在冰上裂解30 min。隨后將液體轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中,4 ℃條件下離心,吸取上清,BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。以最低濃度為標(biāo)準(zhǔn),加入一定量裂解液將各組蛋白調(diào)整至等濃度后,用等體積的蛋白上樣緩沖液稀釋,SDS-PAGE電泳分離。320 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入稀釋比例均為1 ∶1 000的TLR4、IκB、p-IκB、NF-κB、p-NF-κB及GAPDH一抗稀釋液于4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次后,加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗置搖床上室溫孵育1 h,采用ECL發(fā)光后膠片暗室曝光顯影。用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析,結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的光密度比值表示。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠脛骨的X線影像比較

假手術(shù)組骨組織影響表現(xiàn)正常,骨質(zhì)密度均勻,骨皮質(zhì)連續(xù),無(wú)缺失現(xiàn)象;而模型組大鼠的脛骨可見(jiàn)骨結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變和破壞,骨質(zhì)密度明顯不均勻,并伴有缺失現(xiàn)象,骨皮質(zhì)缺損,周?chē)M織明顯腫脹(見(jiàn)圖1)。說(shuō)明骨癌痛大鼠模型成功建立,為后期藥效學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

2.2 OMT改善骨癌痛大鼠的機(jī)械痛行為

對(duì)于同一時(shí)間點(diǎn)不同組間來(lái)說(shuō),各組大鼠在術(shù)前1 d的機(jī)械痛閾值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表1),說(shuō)明實(shí)驗(yàn)大鼠的均一性較好;術(shù)后7 d,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠機(jī)械縮足反射閾值明顯降低,說(shuō)明骨癌痛大鼠出現(xiàn)機(jī)械痛敏。而給予7 d低高劑量OMT和鹽酸曲馬多治療后的大鼠與模型組大鼠比較,機(jī)械縮足反射閾值隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05),且呈劑量依賴(lài)性。而對(duì)于同組間不同時(shí)間點(diǎn)來(lái)說(shuō),假手術(shù)組不同時(shí)間點(diǎn)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與術(shù)前1 d相比,模型組和各給藥組其余時(shí)間點(diǎn)機(jī)械縮足反射閾值明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與術(shù)后7 d相比,模型組剩余其他時(shí)間點(diǎn)的機(jī)械縮足反射閾值無(wú)顯著性差異,說(shuō)明模型的穩(wěn)定,而各給藥組在術(shù)后11 d和14 d的機(jī)械縮足反射閾值明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 骨癌痛模型組和假手術(shù)組大鼠脛骨X線影像對(duì)比

表1 每組大鼠機(jī)械縮足反射閾值的比較 (g,n=10)

Table 1 Comparison of pawmechanicalwithdrawal threshold of rats among five groups (g,n=10)

組別 術(shù)前1d術(shù)后7d術(shù)后9d術(shù)后11d術(shù)后14d 假手術(shù)組14.50±1.5813.30±2.7913.80±2.5714.00±2.1113.10±3.11 模型組14.00±2.113.67±1.57##a3.22±1.83##a2.96±1.34##a2.90±1.69##a 50mg/kgOMT組13.80±2.573.62±1.73a4.20±1.48a4.74±1.80?a5.40±1.35??a 100mg/kgOMT組14.30±2.213.36±1.85a5.14±2.05?a6.00±1.89??ab6.40±2.07??ab Tramadol組13.60±2.953.42±1.52a5.40±1.35?a6.60±1.65??ab7.00±1.41??ab

與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與術(shù)前1 d比較,aP<0.01;與術(shù)后7 d比較,bP<0.01

2.3 OMT對(duì)骨癌痛大鼠DRG處星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

模型組DRG處星形膠質(zhì)細(xì)胞百分比較假手術(shù)組相比顯著升高(28.17%±3.06%vs3.19%±1.71%,P<0.01,見(jiàn)圖2);而50 mg/kg OMT組和Tramadol組大鼠的DRG處星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目百分比明顯降低至19.65%±2.55%,15.49%±1.58%和13.68%±2.62%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 OMT對(duì)骨癌痛大鼠DRG中炎癥因子釋放的影響

與假手術(shù)組相比,模型組IL-1β、IL-6和TNF-α濃度明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,OMT不同劑量組及鹽酸曲馬多組DRG組織中IL-1β、IL-6和TNF-α釋放量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)表2)。

GFAP(紅色)染色星形膠質(zhì)細(xì)胞,DAPI(藍(lán)色)染色細(xì)胞核

A.各組大鼠DRG處星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況 (bar=25 μm) B.定量分析各組大鼠DRG處GFAP陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比 (n=5)

圖2 比較各組大鼠DRG處星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況

Figure 2 Comparison of activation of astrocyte in DRG in rats among five groups

表2 各組大鼠中相關(guān)炎癥因子的表達(dá) (ng/L,n=5)

Table 2 Comparison of related inflammatory factors in rats among five groups (ng/L,n=5)

組別 IL-1βIL-6TNF-α 假手術(shù)組62.51±10.29295.39±38.68 505.66±99.31模型組241.05±39.91##879.27±98.00##1997.53±79.45##50mg/kgOMT179.15±15.51??710.35±50.89?1501.93±102.36??100mg/kgOMT146.94±18.23??609.45±52.50??1286.53±171.02??Tramadol137.11±28.57??580.91±86.54??1025.67±133.19??

與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.5 OMT對(duì)骨癌痛大鼠脊髓中TLR-4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比,模型組TLR-4、p-IκB和p-NF-κB蛋白表達(dá)量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,不同劑量OMT組和鹽酸曲馬組TLR-4、p-IκB和p-NF-κB表達(dá)均能降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),而各組DRG內(nèi)IκB和NF-κB蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化(P>0.05,見(jiàn)圖3)。

3 討論

腫瘤骨轉(zhuǎn)移引起的骨癌痛是臨床常見(jiàn)的慢性疾病,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,且無(wú)有效治愈藥物。脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRG)是痛覺(jué)的初級(jí)傳入神經(jīng)元,在疼痛傳導(dǎo)及發(fā)生過(guò)程中具有重要作用。因此,DRG始終是疼痛機(jī)制和疼痛治療研究中的重點(diǎn)對(duì)象[7]。有研究表明,DRG的致敏作用能夠促進(jìn)腫瘤誘導(dǎo)痛覺(jué)過(guò)敏和產(chǎn)生疼痛,并且以DRG為靶點(diǎn)進(jìn)行治療緩解疼痛的效果良好[8]。因此,本研究通過(guò)左后肢脛骨注射walker256乳腺癌細(xì)胞懸液的方法制備大鼠骨癌痛模型,旨在探討氧化苦參堿對(duì)骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及其作用機(jī)制。揭示了氧化苦參堿可通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠DRG內(nèi)炎癥免疫反應(yīng),抑制TLR-4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

在骨組織中生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞刺激破骨細(xì)胞導(dǎo)致骨破壞和骨膜牽拉,引起局部缺血和周?chē)窠?jīng)受壓,并誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞活化。有研究發(fā)現(xiàn)在骨癌痛大鼠模型中,脊髓、DRG和癌旁處星形膠質(zhì)細(xì)胞大量活化增生,能夠釋放包括IL-1β、IL-6和TNF-α等在內(nèi)的各種促炎因子[9]。IL-1β、IL-6和TNF-α是產(chǎn)生持續(xù)性疼痛的重要介質(zhì),具有改變細(xì)胞膜通透性,促進(jìn)Na+內(nèi)流,降低興奮性閾值,從而產(chǎn)生疼痛[10]。此外,膠質(zhì)細(xì)胞激活后除參與炎癥反應(yīng)外,還與嗎啡耐受形成有關(guān)。Pan等[11]報(bào)道稱(chēng)鞘內(nèi)注射N(xiāo)av1.7 shRNA慢病毒載體可抑制DRG內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,從而改善疼痛,并且在嗎啡耐受型骨癌疼痛模型大鼠中也具有相同的效果。本研究結(jié)果也證實(shí),氧化苦參堿顯著降低了DRG處星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目百分比,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化;同時(shí),氧化苦參堿還降低了DRG內(nèi)促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,提示氧化苦參堿的鎮(zhèn)痛作用與調(diào)控大鼠DRG內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。

TLR4是首先被報(bào)道的人類(lèi)Toll樣受體,是炎癥信號(hào)傳遞過(guò)程中的“門(mén)戶蛋白”,在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)[12]。有研究表明,特異性阻斷TLR4可顯著提高骨癌痛大鼠的機(jī)械縮足反射閾值,起到鎮(zhèn)痛作用[13]。NF-κB是普遍存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,位于TLR4下游信號(hào)通路的樞紐位置,可調(diào)控TNF-α、NO等多種疼痛相關(guān)因子的表達(dá)[14]。NF-κB通常以p50/p65二聚體形式存在于細(xì)胞內(nèi)。生理狀態(tài)下,NF-κB蛋白p50/p65二聚體在胞漿中與抑制蛋白κB(inhibitor kappa B, IκB)結(jié)合,使其不能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),處于非活化狀態(tài)。而當(dāng)細(xì)胞受到外界炎癥刺激后(比如LPS、IL家族成員等),使IκB的激酶IKK被激活,使IκB被磷酸化,磷酸化的IκB會(huì)發(fā)生泛素化并快速降解,導(dǎo)致NF-κB蛋白被釋放,并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮生物活性,并與靶基因結(jié)合,誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)靶蛋白合成,從而發(fā)揮生物效應(yīng)[15,16]。TLR-4/NF-κB信號(hào)通路被激活后,可調(diào)控IL-1β、IL-6和TNF-α等多種炎癥因子的表達(dá),并且IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子也對(duì)TLR-4/NF-κB信號(hào)通路有激活的反饋調(diào)節(jié)作用,從而形成反饋環(huán)路,共同參與骨癌痛的病理進(jìn)程[17]。Tian等[18]證實(shí)沙利度胺可通過(guò)抑制骨癌痛大鼠中樞系統(tǒng)內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及NF-κB活性,起到減輕疼痛的目的。Song等[19]報(bào)道了米諾環(huán)素可通過(guò)抑制大鼠中樞系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的NF-κB活性來(lái)減輕大鼠骨癌痛。為了證明氧化苦參堿抑制免疫炎癥反應(yīng),減輕疼痛與TLR-4/NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)性,我們利用Western blot檢測(cè)了大鼠DRG內(nèi)TLR4、IκB、p-IκB、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予氧化苦參堿治療后骨癌痛大鼠DRG內(nèi)TLR4、p-IκB和p-NF-κB蛋白表達(dá)量顯著降低,說(shuō)明氧化苦參堿調(diào)控大鼠DRG內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)、緩解骨轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)的疼痛與抑制TLR-4/NF-κB信號(hào)通路活性有關(guān)。

綜上所述,本研究證明了氧化苦參堿可提高骨癌痛大鼠的機(jī)械痛閾值,抑制DRG處星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及促炎因子釋放;并且證明了其上述作用與抑制TLR-4/NF-κB信號(hào)通路活性有關(guān),但是其具體分子生物學(xué)機(jī)制,尚需進(jìn)一步研究。