白藜蘆醇對成年期追趕生長大鼠骨骼神經肽Y表達及骨密度的影響

王素星,杜夢穎,張華星,魏金剛,邵偉華,呂彩霞,姚麗霞*

(1河北省人民醫院老年病二科,石家莊 050051;2河北省人民醫院醫務處;3石家莊市第五醫院外科;*通訊作者,E-mail:83312832@qq.com)

追趕生長是機體在營養、疾病等不利因素影響下出現生長受抑,并在相關因素解除后出現的快速生長現象,可出現在胎兒期、嬰幼兒期、青少年期和成年期[1]。已有相關研究多關注宮內發育遲緩模型(IUGR)[2,3],實際上成年期追趕生長現象更為常見[4],但對其研究并不深入,亦未引起足夠重視。追趕生長的本質為能量攝入的波動,機體能量攝入的改變可被外周及中樞攝食信號傳輸至下丘腦,后者精細地調控能量代謝[5]。神經肽Y(neuropeptide Y,NPY)作為下丘腦刺激食欲的主要神經遞質[6],與攝食密切相關,廣泛分布于哺乳動物各器官,通過與靶器官上不同受體特異性結合參與調節機體多種重要的生理活動,尤其對骨代謝的調節作用較為顯著[7]。其中,NPY與NPY1、NPY2受體在骨代謝中發揮重要作用。NPY2受體主要在中樞調節骨代謝,NPY過表達可明顯抑制骨形成,同時NPY-/-小鼠骨生成的面積和速度明顯增加[8]。NPY1受體主要存在于外周骨組織,NPY與外周成骨細胞特異性NPY1受體結合后抑制成骨細胞活性和骨生成,成骨細胞NPY1受體缺失可使股骨松質骨體積、小梁厚度和小梁數目顯著增加,成骨細胞活性增強,同時皮質骨和骨膜表面的礦物質沉積率增加,股骨直徑增加[9]。亦有研究顯示,NPY通過中樞和外周神經組織中的NPY2受體抑制去甲腎上腺素和皮質酮的產生或釋放,從而減少骨骼在慢性應激期間的丟失[10]。

白藜蘆醇是一種存在于紅酒中的多酚,多項研究已證實白藜蘆醇與骨代謝密切相關[11,12]。白藜蘆醇可提高成骨細胞堿性磷酸酶和脯氨酰羥化酶活性,增加成骨細胞的DNA合成,促進成骨細胞增殖和分化[11];亦可激活成骨轉錄因子CBFA-1,增強骨特異性Ⅰ型膠原的轉錄,刺激成骨細胞的增殖和分化,并激活沉默信息調節因子(silent information regulator 1,Sirt-1)使骨組織細胞向成骨細胞轉化和成骨[12]。白藜蘆醇是骨骼保護劑,NPY亦與骨代謝密切相關,在成年期追趕生長,能量的波動使NPY發生怎樣的變化,白藜蘆醇對NPY有何影響,目前尚無報道。本研究以成年期追趕生長大鼠為研究對象,觀察白藜蘆醇對股骨NPY蛋白和NPY mRNA表達的影響,探討白藜蘆醇對成年期追趕生長大鼠骨密度影響的可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑

白藜蘆醇,粉劑,純度99%(Sigma,St Louis,MO,USA)。兔抗大鼠NPY抗體(Abcam Company,USA),山羊抗兔IgG(H+L,HRP);RT-PCR試劑盒和實時定量試劑盒購于大連TaKaRa公司;核糖核酸提取試劑盒(Triozol Reagent,Invitrogen Life technologies,USA),血清NPY測定ELISA試劑盒(Elabscience,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 實驗動物

6周齡雄性SD大鼠60只,SPF級,體質量160 g±20 g,購自河北醫科大學科研實驗動物飼養中心。實驗動物質量合格證號:SCXK(冀)2013-1-003。

1.3 動物分組與處理

60只大鼠適應性喂養1周,隨機分為6組,每組10只:4周組3組(正常飲食4周組、熱卡限制4周組,熱卡限制白藜蘆醇干預組)和12周組3組(正常飲食12周組、追趕生長組、追趕生長白藜蘆醇干預組)。分別在實驗第4和12周末進行相關指標檢測,統計學分析僅限于相同時間點組別之間進行。追趕生長組模型的制作參閱課題組以前模式:前4周給予正常飲食組相同體質量大鼠進食量60%的標準基礎飼料,然后給予正常飲食組相同體質量大鼠進食量等量的標準基礎飼料8周[1,4]。熱卡限制白藜蘆醇干預組為限制飲食同時予以白藜蘆醇治療4周;追趕生長組為限制飲食4周+正常飲食8周;追趕生長白藜蘆醇干預組為限制飲食4周+正常飲食同時白藜蘆醇干預8周。標準基礎飼料購自河北醫科大學實驗動物學部。正常飲食4/12周組自由進食,熱卡限制4周組給予正常飲食組相同體質量大鼠進食量60%的標準基礎飼料。白藜蘆醇用生理鹽水配制成濃度15 mg/ml的懸濁液,根據體質量每天灌胃給予白藜蘆醇(100 mg/kg)干預[1],熱卡限制4周組和追趕生長組灌胃給與同體積生理鹽水。

1.4 骨密度檢測

分別在實驗的第4和12周末,大鼠禁食過夜,精確稱量體質量,腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉,待大鼠肌力消失,呼吸平穩,仰臥位將四肢用膠帶固定于硬紙板,用美國GE Lunar公司生產的DEXA儀從鼻尖掃描至尾端,行全身及多部位BMD測定[13]。所得數據左右大腿合計為大腿部,除頭部外合計為全身。

1.5 Western blot測定骨骼NPY蛋白表達

取股骨,剝離肌肉和結締組織,將骨組織在液氮中研磨成粉,參照文獻[14]方法提取并定量組織蛋白。取40 μg蛋白樣品行SDS-PAGE、轉膜、封閉,分別用NPY、β-actin 4 ℃孵育過夜;次日洗膜、二抗孵育1 h、顯影并分析。

1.6 RT-PCR測定骨骼NPY mRNA

Trizol法提取大鼠股骨頭總RNA,分光光度計檢測提取樣品260 nm、280 nm的吸光值。計算OD260/OD280(R值),檢測RNA純度。按SYBRRR PrimeScripTMRT-PCR Kit說明進行反轉錄和quantitative real-time PCR擴增。RT-PCR數據收集由系統自帶軟件完成,通過軟件計算所有樣品的Ct值,以GAPDH作為內參基因進行校準。采用2-ΔΔCt方法對目標基因NPY mRNA表達進行相對定量。引物由上海生物工程技術有限公司合成。NPY引物:上游5′-TAGGTAACAAACGAATGGG GCTGTG-3′,下游5′-CGCGTCCTCGCCCG GATTGTC-3′,GAPDH引物:上游5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′,下游5′-CCACCCTGTTG CTGTAGCCATA-3′。

1.7 血清NPY濃度測定

用酶聯免疫吸附法測定血清NPY濃度,按照試劑盒說明書操作,在450 nm波長下測光密度值(OD值),計算血清NPY含量。

1.8 統計學分析

所有實驗數據采用SPSS13.0軟件統計分析,以單因素方差分析比較組間差異,各均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗,數據以均數±標準差表示。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨密度變化

熱卡限制后,與正常飲食4周組相比,熱卡限制4周組全身及大腿骨密度下降明顯(P<0.05)。恢復飲食后,追趕生長組全身及大腿骨密度與正常飲食12周組比較,差異無統計學意義(P>0.05);與追趕生長組相比,追趕生長白藜蘆醇干預組全身及大腿骨密度顯著升高(P<0.05);與熱卡限制組相比,熱卡限制白藜蘆醇干預組全身及大腿骨密度呈下降趨勢(P<0.05,見圖1)。

與正常飲食4周組相比，*P<0.05，**P<0.01；與熱卡限制4周組相比，#P<0.05；與正常飲食12周組相比，△P<0.05；與追趕生長組相比，&P<0.05

2.2 骨骼NPY Western blot結果

與正常飲食4周組比較,熱卡限制4周組股骨NPY的表達明顯增加(P<0.01),重飼后,追趕生長組NPY表達有所下降,但至實驗結束仍明顯高于正常飲食12周組(P<0.01);熱卡限制白藜蘆醇干預組股骨NPY輕度下降,與熱卡限制4周組差異無統計學意義,仍顯著高于正常飲食4周組(P<0.01),追趕生長白藜蘆醇干預組股骨NPY表達較追趕生長組顯著減少(P<0.01),與正常飲食12周組差異無統計學意義(P>0.05,見圖2)。

1.正常飲食4周組;2.熱卡限制4周組;3.熱卡限制白藜蘆醇干預組;4.正常飲食12周組;5.追趕生長組;6.追趕生長白藜蘆醇干預組;與正常飲食4周組相比，**P<0.01;與正常飲食12周組相比,##P<0.01;與追趕生長組相比,&&P<0.01

2.3 骨骼NPY RT-PCR結果

由2-ΔΔCt可知,與正常飲食4周組比較,熱卡限制4周組骨組織中NPY mRNA表達明顯上調(P<0.01);開放飲食8周后,追趕生長組股骨組織中NPY mRNA表達有所下降,但仍顯著高于正常飲食12周組(P<0.01)。與熱卡限制4周組相比,熱卡限制白藜蘆醇干預組骨組織NPY mRNA 表達輕度下降(P>0.05),但仍顯著高于正常飲食4周組(P<0.01);追趕生長白藜蘆醇干預組骨組織NPY mRNA表達較追趕生長組顯著減少(P<0.01),達到正常飲食12周組水平(P>0.05,見圖3)。

與正常飲食4周組相比，**P<0.01；與正常飲食12周組相比，##P<0.01；與追趕生長組相比，&&P<0.01

2.4 血清NPY水平比較

熱卡限制4周組血清NPY明顯升高,與正常飲食4周組相比,統計學差異顯著(P<0.01)。實驗結束時,追趕生長組血清NPY水平顯著高于正常飲食12周組(P<0.01)。與追趕生長組相比,追趕生長白藜蘆醇干預組血清NPY水平下降明顯(P<0.01),達到正常飲食12周組水平(P>0.05),熱卡限制白藜蘆醇干預組NPY水平較熱卡限制4周組明顯下降(P<0.01),但仍較正常飲食4周組高(P<0.05,見圖4)。

與正常飲食4周組相比，*P<0.05，**P<0.01；與熱卡限制4周組相比，##P<0.01；與正常飲食12周組相比,##P<0.01；與追趕生長組相比，&&P<0.01

3 討論

限食后重飼導致的追趕生長是短期內能量攝入的改變,NPY是對能量攝入及食欲最為敏感的神經遞質[6]。NPY不僅存在于中樞神經系統中,也存在于外周骨組織、脂肪組織、血管、腎臟組織等,參與調節機體多種重要的生理活動,尤其對骨代謝的調節作用較為顯著[7]。本研究結果顯示,NPY在成年期追趕生長大鼠模型中,熱卡限制4周末骨骼NPY表達顯著增高,恢復飲食后有輕度降低,但至實驗結束仍顯著高于正常飲食組。同時,本研究亦顯示,熱卡限制可導致骨密度顯著下降,恢復能量供應后的追趕生長可顯著提升骨密度。既往諸多研究發現NPY與骨代謝密切相關。神經肽Y水平與成骨細胞活性呈負相關,神經肽Y缺失的小鼠顯示出骨量和成骨細胞活性的增加,而下丘腦過表達神經肽Y可引起骨量的顯著減少[8]。經NPY特異性受體拮抗劑治療后骨質疏松小鼠骨礦化增強,骨丟失減少,骨密度增加[9,15]。在本研究中限食期間NPY的表達與骨密度呈相反的變化趨勢,推測熱卡限制導致骨骼中NPY表達增加進而抑制了成骨細胞的活性,導致骨生成減少,骨密度降低。同時在限食期間,大鼠體質量減輕,骨骼承受的機械力減小,NPY表達的增加負性調控骨生成,減少機體在骨骼生成代謝方面的能量消耗,以保障重要器官的能量供給。因此,NPY在追趕生長過程中的熱卡限制階段調節了骨穩態。

白黎蘆醇是一種具有強生物活性的天然多酚類物質,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學作用。目前研究已證實,白藜蘆醇與骨代謝密切相關,有抗骨質疏松作用[11,12]。本研究顯示,白藜蘆醇對恢復飲食后的追趕生長期的大鼠骨密度有提升作用,同時顯著降低了NPY在骨組織的表達。雖然白藜蘆醇與NPY均已被證實與骨代謝關系密切,但目前國內關于白藜蘆醇對NPY影響的研究較少。國外研究目前主要集中在白藜蘆醇對下丘腦NPY的影響,并且研究結果存在爭議。其中一項研究發現,白藜蘆醇可使高脂飲食的小鼠下丘腦弓狀核生成NPY減少,進而影響脂肪生成,降低體質量[16]。白藜蘆醇通過過表達厭食肽(前阿片蛋白)和抑制食欲肽(神經肽Y)恢復神經元中的瘦素信號,從而減少食物攝入[17]。也有研究發現,白藜蘆醇能顯著提高前額葉皮層神經遞質多巴胺和5-羥色胺水平,增加腦內NPY的表達,對抑郁癥有拮抗作用[18]。本研究中白藜蘆醇對骨骼NPY的表達及血清NPY水平均有明顯抑制作用。多項研究已證實NPY對骨生成存在顯著的負性調節作用[8,9,15],白藜蘆醇通過抑制骨骼NPY的表達,促進骨生成。另外,白藜蘆醇是SIRT1的強力激活劑,有研究顯示,在糖皮質激素誘導的骨質疏松小鼠模型上,沉默NPY的表達可激活SIRT1信號通路,從而改善骨骼損傷[19]。外源注射煙酰胺腺嘌呤二核苷酸可部分通過激活SITR1的表達進而抑制NPY的轉錄活性[20]。以上研究結果可得出,SIRT1與NPY的表達存在負性調控作用,一方表達的增強會抑制另一方的表達。本研究中,白藜蘆醇亦可通過激活SIRT1抑制NPY的表達,進而提升骨密度。

需要注意的是,本研究結果顯示白藜蘆醇在機體不同能量供應狀態下對NPY的影響程度不同。熱卡限制期間,白藜蘆醇使骨骼NPY的表達輕度下降,與未干預前差異無統計學意義。重飼后,白藜蘆醇可使骨骼NPY表達顯著下降,恢復至正常對照水平。與此同步的是,白藜蘆醇僅在追趕生長白藜蘆醇干預組對骨密度有提升作用,在熱卡限制白藜蘆醇干預組對骨密度影響不明顯。研究顯示食物缺乏可使成骨細胞活性受抑[21]，本研究中減少40%的食物攝入使得骨形成所需的基本原料明顯減少，成骨細胞活性受抑，能量分配首先確保機體的關鍵器官基本代謝活動。在此種情況下,即使應用骨保護劑,促進骨形成的作用可能亦不明顯,對某些負性調控骨生成基因(如NPY)表達的抑制作用不會太顯著。一旦能量供應恢復,在追趕生長白藜蘆醇干預組,機體的饑餓應激解除,白藜蘆醇對骨骼NPY表達的抑制作用得以呈現,使其骨密度顯著提升。據此推論白藜蘆醇的骨骼保護作用依賴于機體能量供給。

另外，血清NPY與骨骼NPY表達在追趕生長過程中的趨勢不盡相同。熱卡限制期間，血清NPY濃度與骨骼NPY表達均呈顯著升高趨勢，但開放飲食后，骨骼NPY表達呈下降趨勢，但血清NPY水平變化不明顯。因機體中下丘腦及其他器官都能分泌NPY[22]，故推測，血清NPY來源于除骨骼以外的其他器官。同時,本研究中為了避免實驗動物重飼時過飽,按體質量匹配投喂的食量對于機體饑餓后的需求相對不足,故下丘腦及受控于下丘腦的靶器官可能仍繼續分泌較多的NPY。推測延長追趕時間,血清NPY水平及骨骼NPY表達應可恢復至正常對照水平。

綜上,白藜蘆醇可能通過降低成年期追趕生長大鼠骨組織NPY的表達,同時降低血清NPY濃度,進而提升全身和局部骨密度,發揮對追趕生長大鼠的骨保護作用。但白藜蘆醇對骨骼NPY表達的抑制作用依賴于充足的營養供應。在該模型中所涉及到的其他影響骨代謝的基因改變情況需要更加深入的研究。