冷凍復蘇周期不同囊胚移植方案對不同年齡患者妊娠結局的影響

劉景 孔紅嬌 胡繼君 魏雅靜 周夢鴿 王云霞 李娜

輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）最理想結局是獲得一個健康的子代。然而，傳統ART 通常通過增加胚胎移植數目來提高妊娠成功率，但同時伴隨的是多胎妊娠率的顯著增加。目前我國的多胎妊娠率已超過30%，有些生殖中心甚至高達40%以上［1］，是自然多胎妊娠的幾十倍。多胎妊娠是ART 治療后孕產婦最嚴重的并發癥之一。多胎妊娠所導致的妊娠期高血壓、早產和低出生體重兒等并發癥給患者的家庭和社會造成嚴重的負擔［2］。因此為了有效降低多胎妊娠率，不少學者建議行單囊胚移植［3-4］。目前，關于單囊胚移植的研究大部分還只關注臨床妊娠率，活產率作為主要觀察指標的研究較少。為探討既可以保證高妊娠率，又可以降低多胎妊娠率的最佳凍融囊胚移植方案，本研究對在鄭州大學第三附屬醫院生殖中心首次行D5/D6 凍融囊胚移植周期的相關數據進行了回顧性分析，觀察其妊娠結局，旨在為臨床治療提供數據指導。

1 資料和方法

1.1 一般資料本研究回顧性分析2016年1月至2018年7月在鄭州大學第三附屬醫院生殖中心首次進行D5/D6 囊胚凍融移植（freezing-thawed embryo transfer，FET）周期的（n= 2 582）患者病歷資料。納入標準：凍融囊胚移植；自體卵母細胞；子宮內膜厚度≥7 mm。排除標準：反復移植失敗患者；患有基礎疾病；胚胎植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）周期；凍卵與供卵周期；子宮肌瘤或子宮內膜異位癥；其他內分泌疾病；內膜病變；數據不全周期。

1.2 方法根據移植的囊胚數目及評分對女性患者年齡≤37歲組和＞37歲組分別分A、B、C、D、E 5 個亞組。分別為1 枚優質囊胚移植組（A 組）、1 枚非優質囊胚移植組（B 組）、2 枚優質囊胚移植組（C 組）、1 枚優質囊胚和1 枚非優質囊胚協同移植組（D 組）、2 枚非優質囊胚移植組（E 組），分別比較兩組中不同囊胚移植方案的妊娠結局。對主要觀察指標活產率及多胎妊娠率，次要觀察指標植入率、臨床妊娠率、流產率進行組間比較。

1.2.1 胚胎冷凍和解凍采用玻璃化冷凍復蘇試劑盒（Kitazato，日本）。試劑從冰箱內取出后于室溫下平衡至少30 min。將囊胚移入平衡液（equilibrium solution，ES），10 min 后轉入玻璃化冷凍液（vitrification solution，VS）中平衡，于60 s 內將囊胚放至已標記的冷凍載體（Kitazato，日本）上，迅速投入液氮并裝入套管。解凍時，去除載體套管，將胚胎端迅速移至37 ℃解凍液（TS）中，使囊胚在TS 液中平衡1min，再將囊胚移入稀釋液（DS）和洗滌液1、2（WS1、WS2）中各3 min。最后將囊胚移入囊胚培養液（vitrolife，瑞典）中并置于37 ℃，含6% CO2培養箱內（平板培養箱，美國Cook 公司）等待移植。

1.2.2 囊胚評分及分組本中心采用Gardner 評分系統，根據囊腔擴張程度和是否孵化，將囊胚分為6 個時期。1 期：囊胚腔體積小于胚胎總體積的50%；2 期：囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的50%；3 期：囊胚腔完全占據胚胎的總體積；4 期：擴張囊胚，囊胚腔完全占滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄；5 期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6 期：完全孵出囊胚。將內細胞團及滋養層細胞分為A-C 級。內細胞團評分，A：細胞數目多，排列緊密；B：細胞數目少，排列松散；C：細胞數目很少。滋養層細胞評分，A：上皮細胞層有較多的細胞組成，結構致密；B：上皮細胞層有不多的細胞組成，結構松散；C：上皮細胞層有稀疏的細胞組成。根據囊胚的發育階段以及內細胞和滋養層細胞的形態對囊胚進行分級，優質囊胚定義為≥4BB（AA、AB、BA、BB）。因本中心僅冷凍內細胞團評分為A 或B 的囊胚用于移植，所有非優質囊胚定義為＜4BB（AC、BC）。

1.2.3 臨床結局的判定及計算移植后14 d 抽血查驗HCG，陽性者于29 d 后行B 超檢查，測到孕囊者為臨床妊娠；將妊娠未達28 周、胎兒體重不足1 000 g 而終止妊娠者稱為流產；妊娠滿28 周并分娩的活產嬰兒稱為活產；一次妊娠宮腔內同時有兩個或兩個以上胎兒時稱為多胎妊娠。著床率=孕囊數/總移植胚胎數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期患者數× 100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%；活產率= 活產的分娩周期數/移植周期患者數×100%；流產率=流產周期數（早期流產數+晚期流產數）/移植周期數×100%。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計量資料用均數±標準差表示，組間數據比較采用單因素方差分析（ANOVA）；計數資料采用率表示，組間率的比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 年齡≤37 歲的5 組患者基本資料及妊娠結局比較

2.1.1 基本資料5 組共納入2 227 個周期，A 組590 個周期，B 組700 個周期，C 組206 個周期，D 組265 個周期，E 組466 個周期。5 組患者的年齡、體質量指數（BMI）、子宮內膜厚度、FSH 和LH 差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.1.2 年齡≤37 歲妊娠患者不同囊胚移植策略結局的比較與A 組相比，B 組和E 組植入率降低、C組增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）；D組植入率增加（P＞0.05）。與A組比較，B組臨床妊娠率顯著降低（P＜0.05）；而C、D、E 組臨床妊娠率顯著增加，差異均具有統計學意義（P＜0.01）。E組流產率增加，B、C 和D 組降低，差異均無統計學意義（P＞0.05）。與A 組比較，B 組活產率顯著降低（P＜0.05）；而C、D、E 組活產率顯著增加（P＜0.01）。B 組多胎妊娠率增加，但無顯著性差異（P＞0.05）；而C、D、E 組多胎妊娠率顯著增加（P＜0.01），見表2和圖1。

表1 年齡≤37 歲5 組患者的一般資料Tab.1 General information of 5 groups of patients in patients ≤37 years old ±s

表1 年齡≤37 歲5 組患者的一般資料Tab.1 General information of 5 groups of patients in patients ≤37 years old ±s

組別A 組B 組C 組D 組E 組F 值P 值年齡（歲）29.43±3.10 29.76±3.11 29.56±3.31 29.55±3.17 29.23±3.26 1.019 0.359 BMI（kg/m2）23.10±3.34 23.24±3.11 22.90±3.09 22.68±3.20 23.33±3.27 2.204 0.089內膜厚度（mm）9.26±1.57 9.24±1.57 9.19±1.46 9.32±1.56 9.28±1.47 0.238 0.917 FSH（IU/L）6.25±1.95 6.43±2.25 6.14±2.00 6.20±1.92 6.21±1.82 1.456 0.102 LH（IU/L）5.45±3.57 5.25±3.87 6.02±5.15 5.30±4.16 5.12±3.06 2.069 0.082

表2 年齡≤37 歲患者不同囊胚移植策略妊娠結局的比較Tab.2 Comparison of pregnancy outcomes in different blastocyst transfer strategies in patients ≤37 years old

2.2 年齡＞37 歲的5 組患者基本資料及妊娠結局比較

2.2.1 基本資料5 組共納入355 個周期，A 組84個周期，B 組163 個周期，C 組13 個周期，D 組31 個周期，E5 組64 個周期。5 組患者的年齡、體質量指數（BMI）、子宮內膜厚度、FSH 和LH 比較組間差異無統計學意義（P＞0.05）（表3）。

2.2.2 年齡＞37 歲妊娠患者不同囊胚移植策略結局的比較與A 組相比，B 組和E 組植入率降低、C組和D 組增加，差異均無統計學意義（P＞0.05）。與A 組比較，B 組臨床妊娠率降低、C 組和E 組增加，差異均無顯著性（P＞0.05）；D 組臨床妊娠率增加（P＜0.05），差異有統計學意義。D 組流產率增加，B 組、C 組和E 組降低，差異均無統計學意義（P＞0.05）。與A 組比較，B 組活產率降低、D 組和E 組增加，差異均無顯著性（P＞0.05）；而C 組活產率增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。B組多胎妊娠率降低，差異無統計學意義（P＞0.05）；D 組顯著增加（P＜0.05）；C 組和E 組顯著增加（P＜0.01）。見表4和圖2。

圖1 年齡≤37 歲妊娠患者不同囊胚移植策略結局的比較Fig.1 Comparison of pregnancy outcomes in different blastocyst transfer strategies in patients ≤37 years old

表3 年齡＞37 歲5 組患者的一般資料Tab.3 General information of 5 groups of patients in patients ＞37 years old ±s

表3 年齡＞37 歲5 組患者的一般資料Tab.3 General information of 5 groups of patients in patients ＞37 years old ±s

組別A 組B 組C 組D 組E 組F 值P 值年齡（歲）39.93±2.14 40.72±2.32 40.77±2.31 40.58±2.42 40.52±2.35 1.721 0.145 BMI（kg/m2）23.72±2.95 24.21±2.84 24.24±2.79 24.02±3.39 25.97±18.37 0.765 0.549內膜厚度（mm）9.07±1.88 9.34±1.59 9.56±1.30 9.17±1.69 9.52±2.00 0.761 0.551 FSH（IU/L）6.63±1.61 7.10±1.61 6.89±1.32 6.68±1.51 6.66±1.48 1.775 0.133 LH（IU/L）4.29±2.41 4.19±2.53 3.51±1.96 3.84±1.35 4.70±2.58 1.111 0.351

表4 年齡＞37 歲患者不同囊胚移植策略妊娠結局的比較Tab.4 Comparison of pregnancy outcomes in different blastocyst transfer strategies in patients ＞37 years old

圖2 ＞37 歲患者不同囊胚移植策略妊娠結局的比較Fig.2 Comparison of pregnancy outcomes in different blastocyst transfer strategies in patients ＞37 years old

3 討論

許多生殖中心針對年輕患者，為有效降低多胎妊娠風險，更傾向于單囊胚移植［5-6］。近年來大量研究結果支持這一觀點，HARBOTTLES 等［7］研究結果表明，單囊胚移植能顯著降低多胎妊娠率，同時減少早產和低出生體質量兒比例。因此單囊胚移植逐漸被認為是一種降低多胎妊娠率較為理想的移植策略。但是對于不同人群、不同囊胚質量，凍融囊胚移植策略的選擇仍存在爭議。

美國生殖醫學會推薦，年齡＜35 歲的女性患者實施選擇性單囊胚移植；英國衛生保健分會（NICE）建議＜39歲的患者前兩個周期有≥1枚優質胚胎的行單胚胎移植；MANCUSO 等［8］建議＜38 歲的患者行單囊胚移植。且大量研究［9］表明，單胚胎移植周期不僅減少了多胎妊娠的發生率及相關風險，且兩個周期的累計妊娠率及持續活產率可達到一個周期移植兩枚胚胎相同的效果。本中心的既往數據顯示37 歲是影響活產率的年齡拐點（未發表數據）。張玉婷等［10］研究結果也支持這個觀點，38 ～40 歲及41 ～43 歲患者活產率與35 ～37 歲相比呈斷崖式下降，分別為21.5%，8.1%及32.5%。活產率是本研究的主要觀察指標，因此，我們以37 歲為界限來分析不同組別的各個臨床治療結局。本研究結果顯示，年齡≤37 歲患者，單優質囊胚組雖然臨床妊娠率低于移植雙優質囊胚組，但仍可達到50%以上，而多胎妊娠率下降到2.0%；相反，移植雙優質囊胚組雖然臨床妊娠率和活產率分別可達到84.0%和75.7%，但多胎妊娠胎率達57.2%。此結果與先前發表文獻結果［11］一致。多胎妊娠可導致妊娠期高血壓等嚴重并發癥，考慮到母嬰風險增高。因此，當有優質囊胚可移植時，進行單囊胚移植將會是最佳的移植方案。

自二孩政策開放以來，高齡不孕患者逐漸增多，而生育力低下問題備受關注。隨著年齡增長，卵巢功能減退導致卵母細胞數目和質量下降［12］，進而導致妊娠率降低。目前，高齡患者妊娠結局仍不理想，且面臨巨大的倫理挑戰［13］，對于高齡患者凍融周期囊胚移植策略仍在探索中。劉杰等［14］認為＞37 歲患者應根據實際情況及胚胎質量綜合決定移植策略；而呂興鈺等［15］認為＞38 歲患者可行雙囊胚移植。本研究結果顯示，年齡＞37 歲的患者，雖然雙優質囊胚移植后活產率增加，但同時，多胎妊娠率也顯著增加。因此，對于高齡患者，具有2 枚及以上優質囊胚可移植時，筆者建議單囊胚移植。僅有≤1 枚優質囊胚時，建議在詳盡告知雙胎妊娠存在的風險后，患者仍強烈要求移植兩枚囊胚的情況下，可以在成熟的減胎技術支持下進行雙囊胚的移植，并告知如雙胎妊娠建議減胎。

與優質囊胚相比，非優質囊胚的發育潛能降低，對其移植策略仍存在爭議。WINTNER 等［16］研究發現，1 枚優質和1 枚非優質囊胚協同移植時非優質囊胚不會對優質囊胚的植入產生不利影響。而EL-DANASOURI 等［17］卻研究發現，非優質胚胎可能對優質胚胎的植入產生不利影響。非優質囊胚與優質囊胚協同移植后，前者對后者是否有不良影響仍存爭議。本研究結果表明，年齡≤37 歲患者，移植1 枚優質協同1 枚非優質雙囊胚的臨床妊娠率和活產率顯著高于移植單優質囊胚，提示非優質囊胚并未對優質囊胚產生不利影響。但由于多胎妊娠率明顯增高（2.0%vs.55.7%，P=0.000），筆者仍不建議進行雙囊胚移植。年齡＞37 歲的患者，移植1 枚優質協同1 枚非優質雙囊胚組的活產率未明顯高于單優質囊胚組，但多胎妊娠率增加（7.8%vs.38.1%，P= 0.011），建議單囊胚移植。本研究結果也顯示，無論年齡≤37 歲或＞37 歲患者，移植2 枚非優質囊胚組的臨床妊娠率和活產率均高于移植單優質囊胚組，同時，多胎妊娠率也顯著增加，尤其對于年齡≤37 歲患者（2.0%vs.45.1%）。分析其原因，筆者認為本研究結果在一定程度上可能受到胚胎分級方法的影響，即胚胎的形態學評估存在主觀性。我們發現，無論≤37 歲或＞37 歲患者，與單囊胚移植周期相比，無論移植囊胚的質量如何，雙囊胚移植都顯著增加了多胎妊娠率。一些研究［18］表明，雖然向患者解釋兩個周期的選擇性單囊胚移植可以獲得與雙囊胚移植一個周期相似的活產率，但對于一些女性（特別是高齡女性）患者而言，與雙囊胚移植妊娠率增加相比，多胎妊娠的風險是可以接受的。而VAN HEESCH 等［19］和SCOTLAND 等［20］研究表明多胎妊娠遠期情況不太理想。因此綜合考慮妊娠結局和多胎妊娠給母兒帶來的風險，當患者有優質囊胚時，仍建議單囊胚移植。

綜上所述，無論≤37 歲或＞37 歲患者，當患者有≥2 優質囊胚可用于移植時，我們建議單囊胚移植。僅有≤1 枚優質囊胚時，對于≤37 歲患者，不建議行雙囊胚移植；對于＞37 歲患者，建議單囊胚移植，或特殊情況下在成熟的減胎技術支持下進行雙囊胚的移植。