乳品中致敏蛋白的檢測與控制研究進展

翁俊杰，艾蓉，湯旭翔，傅玲琳，王彥波，劉繼超，劉福奇，*

（1.浙江工商大學，浙江杭州310018；2.北京三元食品股份有限公司，北京100163）

食物過敏目前已成為全球共同關注的健康安全問題之一，在過去的十幾年里，食物過敏影響了近8%的成人和5%的兒童[1]。前期研究表明，牛奶、雞蛋、大豆、花生、小麥、堅果類、魚及甲殼類是主要的8 種致敏食物，據統計將近90%的食物過敏都是由這8 種食物引起的[2]。近些年，隨著乳品的普及，由乳品引發的過敏問題也隨之增多，在嬰幼兒中牛乳過敏的比例高達2%～6%[3]。此外，隨著食品工業的快速發展，除了乳品本身，乳品中蛋白質還可以作為原料或者輔料用于制作其他食品，如利用乳清蛋白的持水性、攪打起泡性、乳化性等特性制作面包、餅干、黃油、冰淇淋等食物。因此導致乳品中致敏蛋白也會存在于其他食物中，進而產生致敏隱患。因此如何快速、準確地檢測乳品中的致敏蛋白以及在加工過程中如何更好地控制和降低致敏蛋白的含量顯得至關重要，對減少乳品過敏現象的發生和降低其對人體健康的危害具有重要的現實意義。本文簡要地綜述了近年來乳品中致敏蛋白檢測和控制方法的研究進展及發展趨勢。

1 乳品中致敏蛋白的檢測

1.1 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）已廣泛應用于乳品等食物過敏原檢測，具有高準確度和高靈敏度且操作簡單便捷，可以用于快速、準確地定性和定量分析乳品中過敏原。競爭性ELISA 法和雙抗體夾心ELISA 法是目前用于牛奶過敏原檢測的兩種主要技術方法。抗體的特異性和效價對ELISA 的檢測結果具有重要影響，雙抗體夾心ELISA 法結合了單克隆抗體特異性強和多克隆抗體靈敏度高的優點，研究證實可以達到更好的檢測效果[4]。李亞璞等[5]選擇新西蘭大白兔和BALB/c 小鼠為實驗動物，用牛乳中的β-乳球蛋白抗原分別對其免疫制備抗體，通過抗體純化和特異性測定，制備出具有高特異性和高效價的鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體。該雙抗體夾心ELISA 得到的檢測結果準確性較高，且與食品中的其他致敏蛋白沒有發生顯著交叉反應。He等[6]使用兔抗β-乳球蛋白多克隆抗體開發夾心ELISA法，β-乳球蛋白檢測的線性范圍為31.25 ng/mL～8 000 ng/mL，具有高度的靈敏度和可靠性且其最低檢測限能達到1.96 ng/mL。該法準確檢測了乳品中β-乳球蛋白的含量，且樣本中的β-乳球蛋白平均回收率為104.25%，可用于檢測乳品中的β-乳球蛋白。當然，ELISA 法也存在不足之處，目前尚無法解決含有多種過敏原的乳品等復雜樣品，且受環境的影響較大，存在潛在交叉污染問題。此外食品加工過程中的熱處理、酶解等工藝都可能在一定程度上改變乳品等食物中的蛋白結構，從而改變抗體結合部位，干擾致敏蛋白的ELISA 檢測結果。

1.2 毛細管電泳法

毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）是一種以高壓直流電場作為驅動力和毛細管作為分離通道的液相分離技術，目前已經應用于乳品中蛋白致敏原的檢測。研究表明，牛乳中主要的蛋白，包括乳清蛋白、乳球蛋白、酪蛋白及其主要降解產物para-κ-酪蛋白均可通過毛細管區帶電泳法進行鑒別。Omar 等[7]通過毛細管電泳法成功鑒定和定量了駱駝奶中的乳清蛋白質和酪蛋白，其得到的檢測圖譜與凝膠電泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）一致，但毛細管電泳法分辨率更高、更加易于操作且成本相對低廉。Trimboli 等[8]借助于CE法，對羊奶和牛奶的可識別且獨特的蛋白質譜進行分析，成功定量了羊奶、牛奶混合物中的單一成分含量。但是傳統毛細管電泳法存在電泳過程中產生樣品吸附等問題，從而造成該方法的靈敏度和分離性能下降。為了解決這一問題，劉一等[9]通過對試驗條件和樣品處理的完善優化，發明了一種快速高效的毛細管區帶電泳法。在 25 ℃，30 kV 電壓，pH=7.0 的磷酸鹽緩沖液，壓力進樣5 kPa，紫外檢測波長205 nm 等的試驗條件下，實現了基線分離，經過試驗優化后檢測限也大大降低，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的檢出限分別達到了3.0 mg/mL 和12 mg/mL，從而解決了電泳過程中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的樣品蛋白吸附問題。

1.3 聚合酶鏈式反應檢測

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測的靈敏度高、特異性強，可以用于痕量或成分復雜的乳品過敏原分析。關瀟等[10]根據已知過敏原α-乳白蛋白的基因序列設計了相應的引物，用該特異引物進行PCR 擴增后其靈敏度可達0.04 ng DNA，然后用該PCR 法成功檢測添加在其他食品中的乳白蛋白。研究表明，普通PCR 得到的檢測結果需要電泳驗證才能確定，而且在試驗過程中受環境影響較大，易發生交叉污染，影響其檢測結果，實時熒光PCR 解決了上述問題。賈敏等[11]針對β-乳球蛋白基因序列設計了探針，并基于該探針開展了乳品中β-乳球蛋白實時熒光定量PCR 檢測，變異系數在5%以內，具有快速高效、特異性強、靈敏度高的特點。Se?kin 等[12]通過實時PCR研究了90 種不同的奶酪，確定了奶酪生產中所使用的牛奶的數量和來源，且該實時PCR 已多用于鑒定乳制品來源的動物物種，為后續過敏原的研究和檢測提供了一定借鑒。雖然目前關于實時PCR 在乳品檢測中應用的報道較少，但它可以彌補普通PCR 的不足，是一種具有前瞻性的檢測技術。

1.4 液相色譜-質譜聯用技術

液相色譜-質譜聯用技術同樣是在乳品過敏原檢測方面應用較多的方法，可以實現過敏原的多重定量[5]。Heick 等[13]提出了一種基于液相色譜-三重四極桿質譜的多反應模式，可以同時檢測7 種過敏原的方法。檢測濃度范圍為10 μg/g 至 1 000 μg/g，其中牛奶檢測濃度可低至10 μg/g，證明基于液質聯用的方法是過敏原篩選的有效工具。袁明美等[14]開發了用超高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）測定乳品中β-乳球蛋白含量的辦法，靈敏度和準確度都較高，檢測限可達到1 nmol/L。牛奶酪蛋白是葡萄酒澄清過程中常用的蛋白質，也是葡萄酒的主要過敏原，存在致敏隱患。Tolin 等[15]用十二烷基硫酸鉀和十二烷基硫酸鈉進行蛋白預處理，并借助于LC-MS/MS 法準確檢測鑒定了殘留的澄清蛋白質濃度，分析快速準確，有效地克服了傳統免疫學方法的局限性。Ji 等[16]開發了基于液相色譜-串聯多反應檢測質譜（liquid chromatography-tandem multiple reactions-monitoring，mass spectrometry，LC-MRM/MS）確認和量化食品中牛奶過敏原的方法。在37 ℃，16 h 的反應條件下用酶水解α-乳白蛋白（α-La）、αs1-酪蛋白（αs1-CN）、β-乳球蛋白（β-Lg），再通過使用基質輔助激光解吸/電離-串聯時間飛行質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization with tandem time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF MS）對其進行標識驗證，α-La，β-Lg 和 αs1-CN的線性范圍分別為 0.97 μg/mL～31.25 μg/mL，0.48 μg/mL～31.25 μg/mL 和 0.48 μg/mL～31.25 μg/mL。蛋白質組學的發展為質譜在蛋白水平和肽段水平的定性、定量分析提供了可能。此外，多反應檢測在質譜的廣泛應用使得質譜的特異性、靈敏度、準確度和重現性都顯著提高。

2 乳品中致敏蛋白的控制

2.1 熱處理

蛋白質的結構或空間構象經熱處理會發生改變形成聚合物，這些聚合物可以在一定程度上掩蓋致敏蛋白表位而使蛋白致敏性降低。Fuente 等[17]和Considine 等[18]研究發現熱處理會導致α-乳清蛋白和β-乳球蛋白發生聚集，且隨著處理溫度的升高，大分子量聚集體的數量不斷增加，使蛋白潛在致敏性顯著下降。目前在乳品中廣泛使用的熱處理方式有超高溫瞬時殺菌、高溫短時巴氏殺菌和二次殺菌。Mehr 等[19]研究表明，70 名對牛乳有過敏反應的兒童攝入經強加熱處理的牛乳，結果只有19 名兒童顯現過敏癥狀，證實了熱處理法確實可降低致敏蛋白的致敏性。

研究表明，雖然經過熱處理后會降低乳品致敏性，但在處理過程中乳品的營養價值和風味特性也會發生不同程度的變化。而且由于在熱處理過程中存在化學鍵斷裂和重新形成，可能產生新的抗原表位；或經過熱處理可能會使蛋白質內部的抗原表位暴露，這些都有可能增強其致敏性。蛋白的熱敏性不同和處理方法的不同也會對處理結果產生影響。Xu 等[20]對牛奶蛋白質濃縮物進行熱處理研究發現，α-乳白蛋白經過65 ℃～100 ℃的熱處理后其潛在致敏性有顯著的下降，但是β-乳球蛋白的抗原性在85 ℃和100 ℃下熱處理25 min 后迅速增加，與未處理的樣品相比，熱處理后β-酪蛋白的潛在致敏性顯著增加。費爽雯等[21]研究了不同溫度的熱處理對牛乳中過敏原蛋白致敏性的影響，結果發現經過加熱處理的α-乳白蛋白與免疫球蛋白G（IgG）的結合能力相比于未處理的有顯著增強，β-乳球蛋白的抗原性隨著熱處理強度的增加反而逐漸降低。綜上所述，乳品中致敏蛋白的致敏性受熱處理方式的影響，熱處理的效果與處理溫度、時間、蛋白質的內部特征以及物化條件等有關，因此在研制低過敏性乳制品過程中，需要優化全產業鏈中熱處理相關條件，避免引起抗原性增強的情況。

2.2 糖基化作用

蛋白質的糖基化作用是碳水化合物與蛋白分子上的氨基通過共價鍵發生結合的化學反應（包括美拉德反應）。研究表明，食品中的蛋白質經過糖基化修飾可以改善蛋白分子的乳化性、抗氧化性、熱穩定性、起泡性等功能特性，而且可以修飾改變蛋白分子上的抗原表位使其致敏性降低。Wu 等[22]先將β-乳球蛋白分別與低聚異麥芽糖（isomaltooligosacharides，IMO）、低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）和低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS） 進行反應，再借助于ELISA 法分析反應前后β-乳球蛋白與免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）和免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）結合能力，結果發現經過糖基化處理的β-乳球蛋白的抗原性有明顯降低。María 等[23]研究同樣發現了酪蛋白糖巨肽（casein glycol-macro-peptide，CMP）可以減少β-乳球蛋白消化產物的表位從而使牛乳中β-乳球蛋白的潛在致敏性降低。

研究表明，美拉德反應中的反應條件如反應底物的質量比、溫度、時間等均會影響過敏原致敏性的降低程度。Li 等[24]研究在不同美拉德反應條件下乳清蛋白分離物中β-乳球蛋白致敏性的變化，并優化美拉德反應條件，結果發現在最佳美拉德反應條件下通過用寡聚體異構體糖基化，β-乳球蛋白的抗原性從272.4 μg/mL 降至 30.99 μg/mL，有效降低了約 88.6%。Cardoso 等[25]通過用不同糖類誘導各個乳蛋白的美拉德反應，結果發現對于所有的蛋白質-糖類組合，α-乳清蛋白比β-乳球蛋白更具反應性。美拉德反應雖然可以有效降低致敏性，但由于難以控制反應過程中的復雜變化，可產生一些副產物影響乳品的營養風味，甚至危害人體健康，所以在低敏乳品開發時應充分考慮其安全特性和營養價值，需要嚴格控制美拉德反應的條件以避免有害物質的生成。

2.3 酶水解

胃蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、中性蛋白酶等是目前普遍用于乳品致敏蛋白水解的酶類。這些蛋白酶通過對蛋白質進行水解使其分子量減少，同時還會破壞蛋白質分子上的一些與過敏反應相關的線性表位和空間表位從而降低致敏蛋白的致敏性。近年來科學研究者一直在尋找更適合加工處理的酶，Oliveira 等[26]發現黑脈金斑蝶（D.Plexippus）中的腸道肽酶能夠進行牛奶中蛋白質水解。經肽酶水解后，再經熱處理，β-乳球蛋白的水解性得到進一步顯著提升，降低了潛在的致敏性。此外，研究中還評估了4 種不同肽酶，發現來自橡膠紫茉莉的乳膠肽酶（cryptostegia grandiflora latex proteins，CgLP）和番木瓜的乳膠肽酶（carica papaya latex proteins，CapLP）在降低抗原性和變應原性方面表現出最佳性能，可作為水解牛奶中蛋白質用肽酶的新來源，具有廣泛的應用前景[27]。

研究表明，酶的種類、酶解方式和條件都與致敏蛋白的水解程度有關。各個酶的作用位點均有差異，具體見表1，因此多種酶的共同應用可顯著克服單一酶水解位點的局限性，更好的降低乳品蛋白致敏性。付莉等[28]研究發現用風味蛋白酶和胰蛋白酶對牛乳蛋白進行水解，其蛋白致敏性明顯降低。酶法水解和其他加工處理技術結合使用同樣可以有效降低乳品致敏性，Azdad 等[29]以1000 名對牛奶敏感的摩洛哥人為研究對象，將牛奶中酪蛋白進行熱處理和胃蛋白酶水解，結果顯示，僅3.6%的人報告對牛奶過敏，表明通過熱處理和胃蛋白酶水解足以消除該研究群體中酪蛋白引起過敏反應的大多數表位，其原因可能是加熱變性消除了構象表位，同時胃蛋白酶作用在順序表位上變得更有效。當然，酶水解只能在一定程度上降低乳品蛋白的致敏性，但不能完全消除。在處理過程中，酶類型和反應條件的差異可能導致乳品的風味差異。

2.4 乳酸發酵

乳酸發酵也可以在一定程度上降低乳品蛋白致敏性。研究表明可能的主要機制有兩種，一是乳酸菌在發酵過程中會產生一些肽酶、蛋白酶等具有水解作用的酶，這些酶會水解乳品中的過敏原蛋白，進而降低蛋白致敏性；二是乳酸菌能降低炎癥性細胞因子的分泌，可有效調節人體免疫系統，從而減少過敏[31]。研究發現，發酵菌種和發酵條件對牛乳蛋白的抗原性有重要影響，目前國內外可降低牛乳致敏性的發酵菌種見表2。

表2 可降低牛乳蛋白致敏性的發酵菌種Table 2 Fermentation strain that can reduce the allergenicity of milk protein

2.5 其他方法

此外，研究發現高壓、微波、輻照、超聲波等加工方式可改善乳品致敏性。高壓處理通過影響致敏蛋白分子中的疏水鍵和非共價鍵，從而改變蛋白質的空間構象，起到降低蛋白致敏性的作用。Daniel 等[32]發現高壓預處理增強了胃蛋白酶水解乳清蛋白的能力，更好地降低了乳清蛋白的致敏性。高靜水壓力和高壓微射流技術是目前的研究熱點，王偉等[33]介紹了目前高靜壓技術在降低食物致敏性方面的研究進展。Chen 等[34]研究發現經過動態高壓微流化（dynamic high-pressure microfluidization，DHPM）處理后，半乳糖糖化的β-乳球蛋白與IgE 結合能力得到了有效的降低。高強度超聲波處理也可以更有效降低致敏性，Liu 等[35]探究了超聲波預處理對β-乳球蛋白糖化和變應原性的影響，結果發現其致敏性顯著降低。Ma 等[36]研究發現超聲波處理增加了β-乳球蛋白被胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的程度。以上加工技術對乳品的成分改變較少，減少了營養流失，與酶解、發酵等方法相結合，同樣可以更大程度地降低乳品蛋白的致敏性。

3 展望

乳品過敏原檢測對評價乳品的安全性至關重要。雖然隨著研究的深入，各個檢測技術的準確性和靈敏度都有了很大的提高，也不斷有新的技術被發掘，但如何準確地檢測評估乳品加工過程中的致敏蛋白以及如何排除其他蛋白對檢測的干擾仍是本領域面臨的難題。借助于新的技術手段和理論創新，乳品中致敏蛋白的檢測將更加快捷和準確，以確保乳品安全。目前部分加工處理技術已經可以有效降低乳品中致敏蛋白的致敏性，但對處理過程中發生的復雜的物理化學變化以及影響機制尚不明確，此外，在處理過程中乳品風味改變、致敏性增強，甚至產生有安全隱患的副產物等情況依然存在，實際上這些已經成為影響乳品行業發展的瓶頸問題。因此在后續研究過程中，需要進一步探究致敏蛋白關聯的乳品加工全過程中產生的理化變化，保障乳品的食用品質。