郫縣豆瓣后發酵期氨基酸呈味效果評價及其ACE抑制肽動態分析

彭 杰,冉玉琴,徐煒楨,楊國華,張 良,*

(1.西華大學食品與生物工程學院,食品生物技術四川省高校重點實驗室,四川成都 610039;2.四川省丹丹郫縣豆瓣集團股份有限公司,國家企業技術中心,四川省豆瓣釀制工程實驗室,食品用酶生物發酵技術國家地方聯合工程研究中心,四川成都 611732)

郫縣豆瓣生產工藝獨特,具有味辣香醇、粘稠絨實、紅棕油亮、醬香濃郁等特點[1-2]。其生產工藝可分為前發酵和后發酵兩個階段,前發酵主要是指豆瓣的制曲過程和辣椒坯的預處理[3-4]。后發酵主要是將成熟霉瓣子和成熟辣椒坯按比例混合,加入適量食鹽和水,進入工業條池或傳統陶缸,再經一定時期特有的“翻、曬、露”過程[5-6]。郫縣豆瓣的后發酵是一個復雜關鍵的過程,其中除了微生物之間的代謝作用還包括各類化學成分之間的相互作用,從而形成了郫縣豆瓣獨特的成分和風味。

氨基酸是蛋白質分解的產物之一,它對郫縣豆瓣的色澤、香氣等方面有一定的調節作用,是評價郫縣豆瓣質量的重要指標。在“地理標志產品郫縣豆瓣”的國家標準[7]中,也將氨基酸態氮的含量高低作為郫縣豆瓣質量等級劃分的重要依據。食源性ACE(血管緊張素抑制酶)抑制肽是由蛋白質水解得到,它可以通過與ACE結合,起到降低血壓的作用,更因其與化學藥物相比具有高安全性、無毒副作用,且易吸收、成本低的優點,從而成為研究的熱點[8-9]。目前大部分研究均集中于肽的生物功能特性上,但是在食品加工中,部分肽類除了賦予食品生物學功能特性之外,還為食品提供了基本呈味成分[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

郫縣豆瓣后發酵1月、2月、3月、6月、9月、1年及2年的樣品 成都知名郫縣豆瓣生產企業的生產車間;天冬氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等氨基酸標準品 英國柏楉有限公司(Biochrom);血管緊張素轉化酶(取自兔肺)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸溶液(N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate,HHL) 美國Sigma公司;馬尿酸標準品(hippuric acid,Hip) 酷爾化學科技(北京)有限公司。

30+氨基酸自動分析儀 英國Biochrom公司;Heto lyolab 3000冷凍干燥機 賽默飛世爾科技公司;LC-16液相色譜儀 島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨基酸態氮含量測定 氨基酸態氮含量均參照GB/T 20560-2006《地理標志產品 郫縣豆瓣》[7]所述的方法檢驗。

1.2.2 氨基酸含量測定 稱取豆瓣2.00 g加入適量蒸餾水,在功率300 W(常溫)條件下超聲提取1 h后,過濾,將濾液稀釋20倍,經0.22 μm微孔濾膜過濾后采用氨基酸自動分析儀分析。測定條件:Biochrom Li 型陽離子交換樹脂4.6 μm×200 mm,測定波長570、440 nm;緩沖液流速25.0、31.2 mL/h,柱溫31～76 ℃,茚三酮溶液流速20.0 mL/h,分析時間125 min,進樣量20 μL。每個樣品重復進樣3次。

1.2.3 游離氨基酸對滋味的貢獻度 味道強度值(Taste activity value,TAV)[27]表示各個呈味物質的含量與其閾值的比,本文中以氨基酸自動分析儀測得的游離氨基酸濃度與其對應的閾值[28]之比計算TAV。當TAV值大于1時,認為該物質對呈味有貢獻,而TAV值小于1時認為該物質對呈味沒有貢獻。此方法并未考慮滋味間的消殺、相乘作用,故存在一定局限性。

1.2.4 ACE抑制肽測定

1.2.4.1 馬尿酸標準曲線測定 取1 mmol/L的馬尿酸標準溶液,用雙蒸水分別稀釋成0.5、0.1、0.05、0.01、0.005 mmol/L系列濃度,經0.45 μm濾膜過濾后,進樣分析后得到對應的峰面積。以馬尿酸標準溶液濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線,y=2624700x+9355.96,R2=0.99978。這表明馬尿酸標準溶液在0.005～0.5 mmol/L濃度之間與峰面積的線性關系良好。

1.2.4.2 豆瓣醬中ACE抑制肽的提取 采用李風娟等[29]、劉婉璐等[30]的方法略作改進,郫縣豆瓣在-50 ℃條件下冷凍干燥24 h后粉碎。準確稱取0.500 g凍干粉,加入5 mL蒸餾水,渦旋振蕩2 min充分混勻。超聲功率100 W條件下提取10 min后,再沸水浴10 min。將所得樣液在4000×g條件下離心10 min,上清液以0.45 μm膜過濾待用。

1.2.4.3 豆瓣醬ACE抑制肽活性測定 在賴晨戎等[31]、庹康秀等[32]、姜瞻梅等[33]、吳瓊英等[34]的方法略作改進。取20 μL 5 mmol/L HHL溶液加入5 μL樣品溶液混合均勻后,37 ℃水浴5 min,隨后加入20 μL ACE溶液混勻作為樣品組溶液,在37 ℃水浴30 min后加入5 μL 1 mol/L HCl終止反應(對照組以5 μL 0.1mol/L硼酸硼砂緩沖液(pH=8.3,含0.03 mol/L NaCl)代替樣品)。反應液0.45 μm過濾后用HPLC進樣分析。

1.2.4.4 檢測方法 Kromasil C18色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm),流動相:25%乙腈(含0.05% TFA)-75%超純水(含0.05%TFA),檢測波長228 nm,柱溫25 ℃,流速0.8 mL/min;進樣量10 μL,每個樣品重復進樣3次。

1.2.4.5 ACE抑制肽活性計算 按以下公式進行計算:

式中:A為空白對照組中馬尿酸的峰面積;B為樣品中馬尿酸的峰面積。

1.3 數據處理

樣品選取同一后發酵時間的不同發酵池進行3次重復取樣,測定后計算平均值。采用Excel對數據進行整理統計分析;采用Origin 8.3分析作圖。

2 結果與分析

2.1 不同后熟期郫縣豆瓣氨基酸態氮含量變化分析

郫縣豆瓣中氨基酸態氮主要來自于原料中蛋白質的水解和發酵微生物的自溶,它在評價調味品質量及營養價值等方面具有重要意義[35]。如圖1所示,郫縣豆瓣中氨基酸態氮的含量隨發酵時間增加呈先上升后下降的變化規律,最高含量為0.422 g/100 g(9個月),高于國家標準中特級郫縣豆瓣的要求(≥0.25 g/100 g)[7]。后發酵1年(0.361 g/100 g)和2年(0.375 g/100 g)的郫縣豆瓣氨基酸態氮含量無明顯差異,但均高于后發酵6個月的郫縣豆瓣中氨基酸態氮含量。郫縣豆瓣中氨基酸態氮含量變化與韓國黑豆醬(Daemakjang)[36]和印度蝦醬(Kapi)[37]的中氨基酸態氮含量變化相似,且郫縣豆瓣中氨基酸態氮含量(平均0.356 g/100 g)要高于韓國黑豆醬(<0.200 g/100 g)。

圖1 不同后熟期郫縣豆瓣的氨基酸態氮含量

2.2 不同后熟期郫縣豆瓣游離氨基酸動態變化分析

為了進一步明確郫縣豆瓣后發酵期游離氨基酸的變化情況,揭示其作為發酵調味品生產過程中最復雜和最重要的蛋白質降解情況,不同后熟期郫縣豆瓣游離氨基酸動態變化情況見表1。從表1可以看出,郫縣豆瓣含有20種氨基酸,其中有7種是人體必須氨基酸。發酵各階段含量較高(≥1.00 mg/g)的4種氨基酸分別為:天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和脯氨酸,它們之和占各階段郫縣豆瓣所有游離氨基酸總量的百分比均在45.58%及以上。

表1 不同后熟期郫縣豆瓣氨基酸動態變化(mg/g)

游離氨基酸的總量隨發酵時間的延長至6個月時達到最高,隨后在1年內趨于穩定,發酵至2年時開始下降。濃度相對升高且總量相對最大的天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸,與酵母自溶溢出的氨基酸中質量濃度較高的氨基酸基本相同[38-39],這說明后發酵階段酵母自溶對郫縣豆瓣中氨基酸態氮的增加可能有很大關系。通過研究郫縣豆瓣后發酵期真菌變化的情況,發現目水平相對含量最高的酵母目(Saccharomycetales)占63.21%,而隨著后發酵周期延長,多樣性和相對總量開始下降[22]。因此,可以推測酵母細胞自溶過程中氨基酸自溶溢出,對郫縣豆瓣呈味物質組成做出了較大貢獻,這與潘慧青等[40]對黃酒釀造工藝影響氨基酸態氮合成的研究報道一致。

另外,一些消耗氨基酸的反應未發生,或消耗氨基酸的反應相比蛋白質水解生成氨基酸的速度慢,可能也是游離氨基酸得到有效積累含量較高的原因。氨基酸是豆醬等大豆類發酵調味品的風味形成的重要前體物質,與二羰基化合物發生Strecker反應,與Mailard反應的中間產物發生交互作用,生成郫縣豆瓣特殊的香味物質,賦予豆醬典型的色澤[41]。隨著發酵的進行,氨基酸逐漸被消耗、反應形成郫縣豆瓣典型的風味和顏色,因此含量逐漸降低。

后發酵6個月的郫縣豆瓣中的天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸所占郫縣豆瓣全部游離氨基酸的比例達到了11.93%、8.88%、14.03%,其構成比例顯著高于我國東北豆醬[42]和韓國豆醬(cheonggukjang)[36],特別是脯氨酸的絕對含量,遠高于以上兩者。脯氨酸在蛋白合成、機體的新陳代謝、傷口愈合、抗氧化及免疫反應均發揮著重要的調控作用[43],這為從大健康角度深入研究郫縣豆瓣提供了一種新的思路。

游離氨基酸的總量在各階段中后發酵1個月最高占氨基酸態氮含量的5.21%,這說明郫縣豆瓣中還含有大量未水解的蛋白質、酶解蛋白和小肽類含氮物質,其中的呈味肽、酶解蛋白可能對郫縣豆瓣的風味影響更大,尚需要深入的研究。同時,發酵原料的蛋白質含量、發酵過程中蛋白質酶的活性等諸多因素均影響著郫縣豆瓣后發酵期游離氨基酸的變化情況。若要提高郫縣豆瓣氨基酸態氮的含量,只需要單純提高發酵原料中胡豆瓣的比例即可,但原料的組成配比,對郫縣豆瓣的風味影響更大。

2.3 不同后發酵期郫縣豆瓣氨基酸呈味效果評價

氨基酸是一種重要的呈味物質,氨基酸組成與滋味的形成具有密切的關系。根據氨基酸的味覺強度可大致分為甜、鮮、苦和無味四大類,并計算其TAV值,結果如表2所示。TAV數值越大,貢獻越大[44],用(+)表示;反之,則呈味作用不顯著,用(-)表示。

表2 不同后熟期郫縣豆瓣氨基酸TAV值

由表2可以看出,各個階段中天冬氨酸和天冬酰胺的TAV值>1的氨基酸,它們對郫縣豆瓣的滋味構成發揮了重要作用。除此之外,呈鮮味的谷氨酸的TAV在發酵1個月之后均高于8.00,且在發酵9個月時最高,達到了13.63,遠高于其他幾種呈味氨基酸的TAV值,對郫縣豆瓣后發酵過程中滋味的形成貢獻最大,這與酸菜自然發酵過程中風味的形成相似[45];在發酵9個月時，呈現甜味的丙氨酸和呈現甜苦味的精氨酸占比也較大,為增加郫縣豆瓣口味的復雜性、厚重感也做出了一定貢獻,造就了郫縣豆瓣獨特的品質和滋味。有報道指出,聚谷氨酸-天冬氨酸(pGlu-Asp)、聚谷氨酸-纈氨酸(pGlu-Val)雖然對鮮味直接促進作用不大,但其能提供強烈的助鮮后味[46-47]。日本學者從25種豆醬中分離出了果糖-谷氨酸聚合物(Fru-Glu),發現其能夠有效的提高食物鮮味[48]。

發酵期6個月至2年的郫縣豆瓣為成熟產品,在郫縣豆瓣后發酵2年內各發酵期中所有氨基酸TAV值(0.03～13.63)均低于釀造醬油(0.45～99.30)[49],但高于食醋(0～11.62)[50]。有學者研究了不同后發酵工藝對黃酒氨基酸生成的影響,發現延長后發酵時間3～9 d與提高發酵溫度2～4 ℃均有利于氨基酸態氮和游離氨基酸的積累[40],這與本研究結果差異較大。

18種氨基酸中大部分氨基酸的TAV值隨發酵時間的延長而增加,隨后減少,在9個月時TAV值達到最大。可能是在后發酵初期(0～9個月),微生物及酶系活動占據主要優勢,產生蛋白酶水解蠶豆中蛋白質或微生物代謝產生的蛋白質,導致郫縣豆瓣中游離的氨基酸含量增加,這是郫縣豆瓣鮮味的主要來源,但由于高鹽環境和pH的下降,抑制了這些微生物的生長,使得后期的微生物總數呈下降趨勢[38-39],因此氨基酸的含量出現下降,并且Maillard反應和 Strecker氨基酸降解反應開始消耗所產生的游離氨基酸[40]。因此,在后發酵9個月后,氨基酸含量開始下降。

2.4 不同后熟期郫縣豆瓣ACE抑制肽變化分析

從圖2中可以看出,后發酵期郫縣豆瓣中ACE抑制肽活性整體變化是先升高再降低,在后發酵2個月時活性最高,隨著后發酵時間的繼續延長,ACE抑制肽活性整體呈降低趨勢。可能是在后發酵初期,大量的酶類水解蛋白質形成的肽類及氨基酸對郫縣豆瓣的ACE抑制活性做出了重要貢獻,但隨著發酵時間的延長，Maillard反應消耗了大量的氨基酸從而使ACE活性略有降低,與此同時Maillard反應生成的一些產物如蛋白黑素類物質等,對總ACE抑制活性有著重要貢獻,可使產品保持穩定的高ACE抑制活性[51];另外在整個后發酵過程中可能存在的其它微生物代謝產物,對ACE抑制具有一定補償作用。有研究表明發酵豆醬產品具有良好的ACE抑制活性[29-30],但ACE抑制肽基本不存在于原料自身,而是在發酵過程中受到微生物代謝的影響而積累[50]。有研究表明乳酸菌、米曲霉菌、枯草芽孢桿菌均能夠發酵產生ACE抑制肽[52],而這些微生物在郫縣豆瓣后發酵過程中均廣泛存在[21-22],這為挖掘郫縣豆瓣的生物活性功能提供了一種新的思路。

圖2 不同后熟期郫縣豆瓣的ACE抑制肽活性

郫縣豆瓣ACE抑制肽活性最高達83.90%,其它值均在70.13%及以上,這與劉婉璐[51]發現的甘露糖體系與纖維二糖體系中ACE抑制肽活性研究中的結果相符。有研究表明ACE抑制肽一般具有亮氨酸、脯氨酸含量高的結構特點[53-54],且丁苗等[53]和王雙等[55]也證明純化后的脯氨酸、酪氨酸、色氨酸等對ACE抑制肽活性貢獻較大;另外林凱等[54]也發現ACE抑制肽C末端含有苯丙氨酸時會使其具有較高ACE抑制活性,李風娟等[29]發現后發酵期含量較高的霉菌對ACE抑制活性能產生一些積極的作用。結合表1當中脯氨酸、酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等的變化情況,由此推測郫縣豆瓣后發酵期ACE抑制肽活性較高,可能是因為ACE抑制肽自身結構(氨基酸序列)、發酵體系中還原糖發生的Maillard反應、微生物代謝及產物均對ACE抑制肽的活性起到了積極作用。

有研究表明食品中呈味物質除了游離氨基酸、蛋白質外,肽也發揮了比較重要的作用,且肽在食品中的各種呈味作用是最基本、最傳統的[56]。陶正清等[57]發現肽的味感取決于分子結構中親水基團和疏水基團的含量,其中親水基與鮮味、甜味等誘人風味相關,疏水基與苦味等令人不愉快的風味相關。同時有研究表明,疏水性氨基酸含量受ACE抑制肽活性影響,因此可以推測ACE抑制肽活性對后發酵期的郫縣豆瓣的呈味效果起一定作用。另外在無鹽醬油[58]的研究中發現某些咸味肽能抑制ACE活性。由此看出ACE活性與后發酵期郫縣豆瓣典型風味的形成有一定聯系,具體聯系還需要進一步研究。

3 結論

隨著后發酵時間的延長,郫縣豆瓣中氨基酸態氮含量先增加后降低,在9個月時達到最高0.422 g/100 g,總氨基酸態氮含量在后發酵期1～2年比6個月前的高,且在后熟發酵時間在1～2年后,含量變化不明顯。

在郫縣豆瓣中,游離氨基酸的總量隨時間延長先增加后減少,游離氨基酸總含量在發酵6個月的時候達到最大,隨后在1年內趨于平緩,在2年時開始下降;發酵各階段含量較高(≥1.00 mg/g)的4種氨基酸分別為:天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和脯氨酸,它們之和占各階段郫縣豆瓣所有游離氨基酸總量的百分比均在45.58%及以上。

在后發酵期郫縣豆瓣中ACE抑制肽活性在后發酵2個月時活性最高達83.90%,隨著后發酵時間的繼續延長,ACE抑制肽活性整體呈降低趨勢,但其最低值仍有為70.13%;這可能與豆瓣的ACE抑制肽結構及后發酵期中各類微生物之間的代謝作用和演替過程相關;且ACE抑制肽活性與后發酵期的郫縣豆瓣的呈味效果之間有一定的聯系。

后發酵9個月的郫縣豆瓣氨基酸態氮以及游離氨基酸和TAV值與后發酵2年的郫縣豆瓣無顯著差異,但發酵2年的ACE抑制肽活性則要稍稍優于后者;這或許可為生產企業設定發酵周期,為傳統產業現代化改造或者后期開發功能性產品提供科學依據。

郫縣豆瓣后發酵期大量的微生物代謝演替及復雜的物質能量代謝過程尚未完全揭示,因此在今后的研究中可以重點關注微生物代謝及演替過程與ACE抑制肽含量的相關性及關鍵物質基礎變化對其的影響。