殼寡糖復合固體飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠腸道菌群結構的影響

姜雅杰,王 暢,席茂盛,羅學剛,2,*,陳列歡

(1.天津科技大學生物工程學院,工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室,天津 300457;2.天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心,天津 300457;3.仲愷農業工程學院動物科技學院,廣東廣州 510225;4.廣州優藍海洋生物科技有限公司,廣東廣州 510530)

現今,由飲食過剩引起的慢性代謝性疾病如肥胖和糖尿病的發病率已逐漸成為全世界日益引人注目的社會健康問題;據國際糖尿病聯合會(IDF)統計,2017年全世界的糖尿病患者人數約為4.25億人,而中國糖尿病患者人數已達1.14億,占全球糖尿病患者總數的1/3,而Ⅱ型糖尿病(T2DM)占糖尿病患者總數的90%以上[1-2]。因此,對T2DM預防和有效治療方法的研究具有重要意義和緊迫性。然而,目前的降糖藥物都具有不同程度的毒副作用,因此天然無毒副作用的降血糖產品成為研究熱點。

腸道菌群是人體內最大的微生態系統,一般情況下,人體腸道微生物群落的占比和結構多樣性都是處于相對平衡的狀態,然而,這種平衡在一定條件下會被打破導致宿主疾病[3]。影響腸道微生物菌群的穩態和多樣性的因素有很多,比如使用抗生素、飲食習慣、環境等均會對腸道菌群的穩態與多樣性產生一定的影響[4]。隨著高通量技術的發展,人們對腸道微生態的認識更加的全面,腸道微生態與疾病之間的相互作用也成為研究的熱點。T2DM是一種以代謝紊亂為特征的慢性疾病,其發病原因較為復雜,目前認為其發病主要原因是由于胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起的[5]。不過,也有研究證明,腸道菌群失調也是引起糖尿病的一個重要原因[6]。

殼寡糖(COS)是存在于自然界中的堿性寡糖,它作為一種重要的海洋性功能寡糖,具有降膽固醇[7]、調節免疫[8]等多種特性,同時對腸道菌群有重要的調節作用;β-葡聚糖和水蘇糖都是功能性的糖類,具有促進腸道內有益菌的增殖繼而提高其所占比例、抑制腸道內有害菌的生長、阻止外源性病原菌在腸道的定植、增加機體腸道免疫力等生理功能[9-10]。白蕓豆提取物含有α-AI(天然的α-淀粉酶抑制劑),它可以通過降低淀粉類的消化率來輔助降低Ⅱ型糖尿病病人血糖[11]。亞麻籽油富含α-亞麻酸,α-亞麻酸能有效降低高血脂和高血液粘稠度,改善微循環,有助于糖尿病人的康復。目前市面以殼寡糖為原料并且上市的殼寡糖產品并不多,而以殼寡糖為主要原料并配比白蕓豆、水蘇糖、β-葡聚糖,亞麻籽油的功能性復合固體飲料還尚未見到。

因此,本文參考中醫藥講究的“君臣佐使”理念,以殼寡糖為“君”,白蕓豆提取物為“臣”,水蘇糖和葡聚糖為“佐”,亞麻籽油為“使”,將其合理科學配伍研發了殼寡糖復合固體飲料“殼糖平”;并利用T2DM小鼠模型,運用高通量測序技術就其對糖尿病小鼠腸道菌群的影響,展開較為系統的分析,為其合理應用及保健食品的開發奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼糖平及殼寡糖 廣州優藍海洋生物科技有限公司;昆明小鼠 健康雄性清潔級,4周齡(體重18～22 g),生產許可證:SCXK(軍)2007-004,合格證號:00549571;高脂飼料和基礎飼料 中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心;阿卡波糖片(Acar) 杭州中美華東制藥有限公司;AxyPrep DNA提取試劑盒 AXYGEN公司;KOD Polymerase Illumina公司。

702超低溫冰箱 美國Thermo Forma公司;YDS-50B-20液氮罐 四川亞西機器有限公司;Quanti FluorTM熒光計 Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組和Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立 健康雄性SPF昆明小鼠70只(4周齡,20±2 g),按照體重隨機分組分為7組,正常對照組(NFD)、模型組(T2DM)、陽性對照阿卡波糖組(Acar)、殼寡糖組(COS)、殼糖平低劑量組(LKTP)、殼糖平中劑量組(MKTP)、殼糖平高劑量組(HKTP)。實驗小鼠以基礎飼料適應性喂養一周后,T2DM、Acar、COS、LKTP、MKTP和HKTP組小鼠禁食不禁水12 h,采用65 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)連續3 d進行腹腔注射,造模期間飼喂高脂飼料。注射藥物5 d后,小鼠尾靜脈取血,測定小鼠的血糖,空腹血糖水平≥7.0 mmol/L,餐后2 h血糖水平≥11.1 mmol/L為造模成功[12-13]。小鼠從第3周后開始連續灌胃4周實驗樣品;灌胃定于每天上午9:30開始,其中NFD組、T2DM組小鼠每天PBS(10 mmol/L,pH=7.4)的灌胃量為0.2 mL/只/天,根據小鼠的體重計算Acar組50 mg/kg、COS組80 mg/kg、LKTP組40 mg/kg、MKTP組80 mg/kg、HKTP組120 mg/kg灌胃量,灌胃期間小鼠自由飲食。

1.2.2 小鼠的處理與組織保存 實驗結束后,小鼠禁食12 h,采用斷頸法處死小鼠,進行解剖摘取小鼠橫結腸部分裝于離心管中,迅速置于液氮罐中冷卻,保存于超低溫冰箱(-80 ℃)中備用。

1.2.3 小鼠結腸內容物菌群DNA提取16S和測序 將保存在超低溫冰箱中的結腸內容物取出解凍。利用DNA提取試劑盒提取盲腸內容物微生物總DNA。用帶有Barcode的特異引物擴增16S rDNA的V3+V4區。引物序列為:341F:CCTACGGGNGGCWGCAG;806R:GGACTACHVGGGTATCTAAT[14]。PCR反應體系50 μL:10×KOD緩沖液5 μL、5 μL(2.5 mmol/L)DNTPS、正反引物(5 μmol/L)各1.5 μL、1 μL KOD聚合酶和100 ng模板DNA,補充ddH2O至50 μL;PCR所需要的反應條件:95 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s;退火溫度62 ℃ 30 s;68 ℃ 30 s,27個循環;68 ℃延伸10 min。然后進行PCR擴增產物,運用切膠回收試劑盒回收目的片段,并進行定量。將純化的擴增產物進行等量混合,連接測序接頭,構建測序文庫,運用Hiseq2500 PE250上機測序。

1.3 數據分析

1.3.1 原始測序數據的處理 采用高通量Illumina Hiseq 2500測序得到原始數據。將測序得到的原始下機數據(Raw data)進行預處理。具體的處理步驟如下:a.使用FASTP(https://github.com/opengene/fastp)將原始數據進行過濾;b.使用FLASH軟件包將過濾后數據進行Tags拼接;c.利用QIIME軟件將拼接后的Tags過濾,得到高質量干凈的Tags;d.將過濾后的Tags在數據庫(http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)中進行比對搜索,并使用Uchime算法將比對后高質量Tags去嵌合體,獲得Effective tags用于進一步分析。最后利用Mothur軟件包對Tag序列進行了去冗余處理,從中挑選出Unique tag序列。

1.3.2 OUT聚類 OTU(Operational Taxonomic Units)是指為了方便在系統發生學或群體遺傳學研究,人為設定的分類單元。利用Effective tags之間的序列相似性關系,可以將不同的Tags聚類成OTU。為了研究樣品的物種的組成多樣性信息,用Uparse軟件對所有樣品的全部Effective tags序列聚類,默認提供以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(Operational taxonomic units)結果,并計算出每個OTU在各個樣品中的Tags絕對豐度和相對信息。根據OTU豐度和序列信息,利用SILVA數據庫(https://www.arb-silva.de/)或Greengene數據庫的RDP軟件包分類器,通過一種簡單的貝葉斯模型將代表序列進行微生物分類。用Krona軟件包可視化每個分類的豐度統計。用Metastats軟件和LEFSe軟件進行各組的標志生物篩選。最后利用相關軟件,對每組樣品逐一開展物種注釋、群落多樣性、組間差異等多種核心分析。統計分析采SPSS 17.0軟件進行,P<0.05為有統計學意義差異。

2 結果與分析

2.1 OTU及多樣性分析

由表1可知每個實驗組的有效序列為130301～244496條,其長度范圍在315～478 bp。本研究中各實驗組OTU范圍為1367～1835,腸道菌群的物種覆蓋率大于0.99,表明本研究測序覆蓋率和深度可滿足樣品16S測序分析需求[15]。由圖1A可知,7組小鼠結腸樣品的稀釋曲線在100000趨向于平坦,說明本研究樣品測序數據可靠測序深度滿足要求;如圖1B Shannon-Wiener曲線趨向平坦,說明測序數據物種豐富度高且分布均勻,其中NFD組樣品群落多樣性最高,其它依次是COS組、MKTP組、T2DM組、LKTP組、HKTP組、Acar組。表1可知,NFD組ACE指數(2720.99)、Chao1指數(2745.55)、Shannon香農指數(7.31)值都是最高的,說明高脂聯合STZ誘導的T2DM小鼠腸道菌群發生了顯著變化,使得其腸道菌群的多樣性降低,而灌服COS、LKTP和MKTP提高了Shannon香農指數,說明灌服殼寡糖及殼糖平可有效恢復T2DM小鼠腸道菌群多樣性。

表1 各組樣品有OTUs數量和菌群多樣性

圖1 稀釋曲線(A)和Shannon-Wiener曲線(B)分析

2.2 不同分組之間OTU物種差異和PCA分析

如圖2所示,根據OTU豐度信息開展韋恩圖分析,7組樣本含有的特有的OTU個數分別為326(NFD組)、223(T2DM組)、237(Acar組)、118(COS組)、197(LKTP組)、142(MKTP組)、181(HKTP組)。其中有556個OTU是7組共有。基于OUT數據,組間PCoA圖表明,小鼠腸道樣品情況,其反映在PCoA圖中的距離遠近上,如圖3所示,NFD、T2DM、Acar、COS、LKTP、MKTP和HKTP組內樣品距離相近,說明所有實驗組組內樣品具有良好的平行性和重復性;T2DM組與COS組距離較近,而Acar、LKTP、MKTP和HKTP組與T2DM組距離較遠,說明與T2DM組相比,COS組的處理效應弱,Acar、LKTP、MKTP和HKTP組處理效應強。

圖2 7組樣本OTU水平上的維恩圖

圖3 小鼠腸道樣本PCoA分析

2.3 在門水平上的菌群豐度及差異

基于OUT數據,將微生物由門到種進行各個水平上的分類,如圖4所示,各組小鼠在門(phylum)的水平上的菌群組成主要由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變行菌門(Proteobaterria)、酸桿菌門(Actinobateria)、藍菌門(Cyanobacteria)、Saccharibacteria、疣微菌(Verrucomicrobia)、梭桿菌門(Fusobacteria)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、浮霉菌門(Planctomycetes)等10個菌門組成,其中厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為主要優勢菌,這與Larsen等[16]研究報道一致。與NFD組厚壁菌門(Firmicutes)相比(38.33%),在T2DM組顯著升高(54.57%,P<0.05);而Acar組、COS組、LKTP組、MKTP組、HKTP組與T2DM模型組相比均可顯著降低厚壁菌門豐度(P<0.05),其中Acar組占比28.61%、COS組占比30.40%、LKTP組占比20.00%、MKTP組占比20.76%、HKTP組占比23.89%。與NFD組相比(占比為56.31%),擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度在T2DM組(P<0.05),其中MKTP組占比最高(75.88%)、其次是LKTP組占比74.27%、HKTP組占比67.64%、COS組占比65.90%、Acar組占比64.48%。研究表明,厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)協同作用于宿主能量吸收或代謝[17-18];而糖尿病患者腸道與正常人腸道對比擬桿菌門(Bacteroidetes)顯著性降低,厚壁菌門(Firmicutes)顯著性升高[19-20]。

圖4 7組樣本在門水平上的相對豐度

由此可知,高脂聯合STZ誘導的Ⅱ型糖尿病模型組小鼠厚壁菌門(Firmicutes)升高,擬桿菌門(Bacteroidetes)降低,而灌服殼糖平對Ⅱ型糖尿病小鼠腸道菌群失調具有一定改善調節作用,其中殼糖平中劑量組作用效果最顯著。

2.4 在科水平上的菌群組成及差異分析

如圖5所示,7組樣本在科分類水平上的主要組成菌為:擬桿菌目(Bacteroidales_S24-7_group)、毛螺科菌(Lachnospiraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、普雷沃氏菌(Prevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、脫疏弧菌科(Desulfovibrionaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)等10個菌科;其中擬桿菌目(Bacteroidales_S24-7_group)、毛螺科菌(Lachnospiraceae)為兩種豐度最大的優勢菌,占比超過了57%。與正常對照組(NFD)相比,T2DM模型組擬桿菌目(Bacteroidales_S24-7_group)和普雷沃氏菌(Prevotellaceae)顯著下降(P<0.05),而毛螺科菌(Lachnospiraceae)和脫疏弧菌科(Desulfovibrionaceae)顯著升高(P<0.05)。與模型組(T2DM)相比,Acar組、COS組、LKTP組、MKTP組、HKTP組擬桿菌目(Bacteroidales_S24-7_group)、普雷沃氏菌(Prevotellaceae)顯著升高(P<0.05),而毛螺科菌(Lachnospiraceae)和脫疏弧菌科(Desulfovibrionaceae)顯著降低(P<0.05),其中HKTP組Bacteroidales_S24-7_group升高最明顯,而Lachnospiraceae降低最明顯。如圖6,與陽性藥組(Acar)相比,通過LEFse分析組間菌群差異,殼糖平中高劑量組擬桿菌群占主導,且所占比例較高;相關研究表明,毛螺科菌(Lachnospiraceae)與腸道炎癥程度正相關[21];人類Ⅱ型糖尿病和T2DM模型小鼠的發病可能與Lachnospiraceae相關[22-23]。Desulfovibrionaceae是一種硫酸鹽還原菌,能夠產生毒素并破壞粘膜屏障與炎癥密切相關[24];Prevotellaceae是一種與腸道通透性相關的黏蛋白降解菌[25],在抵御病原菌方面發揮重要作用;腸道中的Bacteroidales_S24-7_group是丁酸鹽產生菌,丁酸鹽是腸道上皮的能量提供源,并有助于腸道對營養物質的消化吸收,從而提高機體的腸道免疫力[26-31]。

圖5 七組樣本在科水平上的相對豐度

圖6 各實驗組的LEFse分析比較

本研究結果表明,灌服殼糖平可以改善T2DM小鼠腸道炎癥程度,促進腸道有益菌的生長而抑制致病菌的增殖,從而使得腸道免疫力增強,同時使得宿主整體內環境協調穩定。

3 結論

腸道微生物可以反向調節宿主健康狀況,本研究結果表明,與模型組(T2DM)相比,灌服殼糖平可顯著增加T2DM小鼠腸道Bacteroidales_、S24-7_group、Prevotellaceae的相對豐度,這些菌可能與改善Ⅱ型糖尿病小鼠癥狀有關;并且,灌服殼糖平使得T2DM小鼠腸道Firmicutes、Lachnospiraceae和Desulfovibrionaceae的相對豐度減少,這些菌可能與Ⅱ型糖尿病發生有關;這些發現表明適當劑量殼糖平具有調節腸道菌群結構、提高腸道免疫力同時輔助治療Ⅱ型糖尿病的功效。