不同品種茶葉指紋圖譜的建立及其相似度評價

張玲玲,孔 娟,李小芬,馮 華,王祥培,吳紅梅,*

(1.貴州中醫(yī)藥大學,貴州貴陽 550025;2.遵義食品藥品檢驗所,貴州遵義 563002)

茶是世界三大非酒精飲料之一,其地位僅次于水[1]。茶是山茶科植物茶(CamelliasinensisO.ktunze)的葉子經(jīng)過加工制成,主要生長在亞洲、非洲和拉丁美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)[2]。研究表明茶葉具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎、降脂減肥等功效[3-11]。茶葉中主要含有茶多酚、茶多糖、茶氨酸、咖啡因等化合物[12-15],其中茶多酚具有抗增殖和抗炎癥的作用,能一定程度預防癌癥、心血管、糖尿病等疾病的發(fā)生[16-19]。此外,茶葉還具有獨特的香氣與味道被廣泛使用在食品、飲料和化妝品等領域[20-22]。茶葉的種類繁多,根據(jù)制作工藝的不同分為未發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶及發(fā)酵茶等[23],如碧螺春、西湖龍井屬于未發(fā)酵茶,大紅袍與鐵觀音屬于半發(fā)酵茶,遵義紅茶屬于全發(fā)酵茶[24-25]。又根據(jù)茶葉的外形、色澤、香氣、凈度等因素影響可劃分為特級、一級、二級等多種等級[26-27]。目前,市場上審評茶葉的品種及品質優(yōu)劣仍以感官為主,理化檢驗為輔,受主觀因素影響較大,導致市場上茶葉質量參差不齊,缺乏可量化的標準[28]。

指紋圖譜是指在固定的實驗條件下將待測物經(jīng)適當處理后得到的能標識其化學特征的譜圖[29],指紋圖譜具有整體性、可量化的特點,已被廣泛應用于中藥質量控制、食品評價、種子檢測和鑒定等領域[30-34]。其中高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜可用于分析茶葉中的非揮發(fā)性成分[35-36],但應用多品種、多廠家、多等級茶葉的研究較少。本文運用高效液相色譜研究不同品種茶葉的指紋圖譜并評價不同品種茶葉及同品種不同等級、不同廠家茶葉的差異,以期為茶葉的質量控制和科學應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10個茶葉品種共33批茶葉樣品(品種有湄潭翠芽、都勻毛尖、遵義紅茶、鐵觀音、綠寶石、碧螺春、西湖龍井、鳳崗鋅硒茶、大紅袍、天柱茶葉) 樣品來源如表1所示;甲醇、乙腈 色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司;磷酸 重慶川東有限公司;沒食子酸(GC)、表兒茶素(EC) 中國藥品生物制品鑒定所;表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG) 純度≥98%,成都普菲德生物技術有限公司。

表1 茶葉樣品來源

Agilent 1260高效液相色譜儀(PDA檢測器) 安捷倫科技有限公司;AG135電子天平、AB265-S電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;KQ-100E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;800Y型多功能粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準品溶液的制備 稱取沒食子酸10.76 mg、表兒茶素10.34 mg、表沒食子兒茶素沒食子酸酯10.00 mg、表兒茶素沒食子酸酯10.26 mg分別用75%甲醇水溶解并配制成沒食子酸0.2152 mg/mL、表兒茶素0.2068 mg/mL、表沒食子兒茶素沒食子酸酯0.8000 mg/mL、表兒茶素沒食子酸酯0.5130 mg/mL的標準品溶液,分別取以上標準品溶液各0.2 mL定容到1 mL,搖勻即可。

1.2.2 供試品的制備 稱取茶樣粉末(過65目篩)0.5 g,置于100 mL圓底燒瓶中,加入75%甲醇水50 mL,加熱回流提取2次,每次30 min,合并濾液并定容到100 mL,搖勻過0.22 μm微孔濾膜,備用。

1.2.3 色譜條件 流動相A為0.2%的磷酸水,流動相B為乙腈;色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),檢測波長為280 nm,柱溫30 ℃,流速1.0 mL/min,進樣量10 μL。分析時間57 min。梯度洗脫方法:0～15 min,5%～10% B;15～32 min,10%～12% B;32～37 min,12%～18% B;37～44 min,18%～20% B;44～49 min,20%～22% B;49～57 min,22%～30% B。系統(tǒng)平衡色譜柱時間為10 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將實驗數(shù)據(jù)導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版進行相似度分析并建立不同品種茶葉指紋圖譜,使用SPSS 19.0 軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 儀器精密度實驗 取產(chǎn)自永興茶葉生產(chǎn)基地的特級湄潭翠芽,按“1.2.2”項下的方法制備,在“1.2.3”項下的色譜條件下連續(xù)進樣5次,進樣量為10 μL,考察儀器的精密度。結果表明,各共有峰的相對保留時間及相對峰面積RSD均小于3%,說明儀器的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性實驗 取產(chǎn)自永興茶葉生產(chǎn)基地的特級湄潭翠芽,按“1.2.2”項下的方法制備提取液,按“1.2.3”項下的色譜條件下分別于0、2、4、8、12、24 h進樣,進樣量為10 μL,考察茶葉提取液的穩(wěn)定性。結果表明,各共有峰的相對保留時間與相對峰面積RSD均小于3%,說明茶葉提取液在24 h穩(wěn)定。

2.1.3 重復性實驗 取產(chǎn)自永興茶葉生產(chǎn)基地的特級湄潭翠芽,按“1.2.2”項下的方法平行制備分析樣品,按“1.2.3”項下的色譜條件分別進樣,進樣量為10 μL,考察實驗方法的重復性。結果表明,各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%,說明該方法的重復性良好。

2.2 指紋圖譜的建立

稱取33批茶葉樣品各0.5 g,精密稱量,按“1.2.2”項下的方法制備供試品,按“1.2.3”項下的色譜條件進樣檢測,提取不同茶葉樣品在280 nm處的色譜圖,導入中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng),進行色譜峰匹配,應用中位數(shù)法,時間窗寬度為 0.3,生成33批茶葉樣品的HPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜,見圖1～圖2,并標定5個共有峰,確認了其中沒食子酸(1號峰)、表兒茶素沒食子酸酯(10號峰)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(14號峰),見圖3。按照上述方法,建立同一品種不同等級、廠家茶葉指紋圖譜,即湄潭翠芽不同廠家、等級的HPLC指紋圖譜(圖4)、鳳崗鋅硒茶不同廠家、等級的HPLC指紋圖譜(圖5)、鐵觀音不同廠家、等級的HPLC指紋圖譜(圖6)、遵義紅茶不同等級的HPLC指紋圖譜(圖7)、都勻毛尖不同等級的HPLC指紋圖譜(圖8)、綠寶石不同等級的HPLC指紋圖譜(圖9),選擇含量相對較高、性質較穩(wěn)定、保留時間居中、峰形好且有較好的分離度及在各樣品中均存在的7號峰為參照峰S,其保留時間和峰面積為 1,并計算其他各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,見表2～表3。

表2 不同茶葉樣品HPLC指紋圖譜共有峰的相對保留時間(min)

續(xù)表

圖8 都勻毛尖不同等級的HPLC指紋圖譜

表3 不同茶葉樣品HPLC指紋圖譜共有峰的相對峰面積(mAU)

續(xù)表

圖1 33批茶葉樣品的HPLC指紋圖譜

圖9 綠寶石不同等級的HPLC指紋圖譜

圖2 33批茶葉對照指紋圖譜

圖3 混合標準品HPLC色譜圖

圖4 湄潭翠芽不同廠家、等級的HPLC指紋圖譜

圖5 鳳崗鋅硒茶不同廠家、等級的HPLC指紋圖譜

圖6 鐵觀音不同廠家、等級的HPLC指紋圖譜

圖7 遵義紅茶不同等級的HPLC指紋圖譜

2.3 相似度評價

2.3.1 不同品種茶葉的相似度評價 將33批茶葉樣品的HPLC色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A 版》軟件中,應用中位數(shù)法,時間窗寬度為0.3,生成對照指紋圖譜并對其進行編號,測得樣品與對照指紋圖譜之間的相似度,不同品種茶葉相似度在0.681～0.999,見表4。

表4 33批茶葉樣品的相似度

2.3.2 各品種不同等級、不同廠家茶葉相似度評價 湄潭翠芽不同等級、不同廠家的相似度在0.968～0.998;鳳崗鋅硒茶不同等級、不同廠家的相似度在0.987～1.000;鐵觀音不同等級、不同廠家的相似度在0.974～0.996;不同等級的遵義紅茶相似度在0.989～1.000;不同等級都勻毛尖相似度在0.989～1.000;不同等級綠寶石相似度在0.996～1.000。結果顯示同品種不同等級、不同廠家茶葉相似度較高,說明同一品種不同等級及不同廠家茶葉的品質較為接近,茶葉品質差異較小,其茶葉品質的差異主要取決于原料及制作工藝等因素的影響,結果見表5～表10。

表5 湄潭翠芽不同等級、不同廠家的相似度

表6 鳳崗鋅硒茶不同等級、不同廠家的相似度

表7 鐵觀音不同等級、不同廠家的相似度

表8 遵義紅茶不同等級的相似度

表9 都勻毛尖不同等級的相似度

表10 綠寶石不同等級的相似度

2.4 共有峰的確定

2.4.1 不同茶葉樣品共有峰的確定 取各品種不同廠家、不同等級茶葉共33批茶樣品進行實驗并測定其結果,綜合33批樣品的色譜圖(圖1),有5個共有峰,分別為1、2、7、10、14號峰,其中確認1號峰為沒食子酸,10號峰為表兒茶素沒食子酸酯,14號峰為表沒食子兒茶素沒食子酸酯,且各批茶葉樣品的5個共有峰總面積占總峰面積的80%以上。此外,還確認9號峰為表兒茶素。西湖龍井有15個共有峰,湄潭翠芽有14個共有峰,天柱茶葉有14個共有峰,鳳崗鋅硒茶有13個共有峰,都勻毛尖有13個共有峰,綠寶石有12個共有峰,碧螺春有12個共有峰,大紅袍有11個共有峰,遵義紅茶有8個共有峰、鐵觀音有8個共有峰,各品種共有峰個數(shù)差異較大,說明不同品種茶葉成分差異大。

2.4.2 不同品種茶葉間共有峰的比較 從共有峰上發(fā)現(xiàn),西湖龍井、天柱茶葉及湄潭翠芽之間比較有13個共有峰,共有峰數(shù)目較多,提示這三種茶葉成分可能更為接近。都勻毛尖、鳳崗鋅硒茶、綠寶石及碧螺春之間比較有11個共有峰,西湖龍井、天柱茶葉、湄潭翠芽與都勻毛尖、鳳崗鋅硒茶、綠寶石及碧螺春比較有10個共有峰,大紅袍及鐵觀音之間比較有8個共有峰,大紅袍、鐵觀音與西湖龍井、天柱茶葉、鳳崗鋅硒茶、湄潭翠芽、都勻毛尖、綠寶石及碧螺春之間有6個共有峰,遵義紅茶與西湖龍井、天柱茶葉、鳳崗鋅硒茶、湄潭翠芽、都勻毛尖、綠寶石及碧螺春之間有7個共有峰,遵義紅茶與大紅袍及鐵觀音比較有5個共有峰,其共有峰數(shù)目減少,提示以上幾種茶葉相似度雖高,但在茶葉成分上有差異。

2.5 指紋圖譜聚類分析

采用SPSS軟件對33個茶樣品共有峰的相對峰面積進行聚類分析(圖10),在標度為11時,可分為3類,即湄潭翠芽(S1～S9)、鳳崗鋅硒茶(S10～S15)、都勻毛尖(S16～S18)、碧螺春(S27)、西湖龍井(S29)、天柱茶葉(S30)及綠寶石(S31～S33)聚為一類,大紅袍(S28)與鐵觀音茶(S22～S26)聚為一類,遵義紅茶(S19～S21)聚為一類,茶葉根據(jù)制作工藝的不同可分為未發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶及全發(fā)酵茶等[23],湄潭翠芽、鳳崗鋅硒茶、都勻毛尖、碧螺春、西湖龍井、天柱茶葉屬于未發(fā)酵茶,大紅袍與鐵觀音屬于半發(fā)酵茶,遵義紅茶屬于全發(fā)酵茶[24-25]。因此,通過對33批茶樣品進行聚類分析,可以區(qū)分發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶及未發(fā)酵茶三種不同制作工藝的茶葉。

圖10 33批次茶葉樣品指紋圖譜聚類分析

3 討論與結論

本研究采用 HPLC 指紋圖譜結合相似度評價對不同品種茶葉、不同廠家茶葉、不同等級茶葉進行分析,除遵義紅茶外,其余茶葉中均含有表兒茶素,有5個共有峰,其中確認了沒食子酸、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯3個共有峰,且不同品種茶葉的相似度為0.681～0.999,不同品種茶葉相似度較低、共有峰個數(shù)差異大,提示不同品種茶葉間可能有較大差異,其中,遵義紅茶的相似度最低為0.681。紅茶屬于全發(fā)酵茶,根據(jù)制作工藝的不同可將茶葉分為未發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶及全發(fā)酵茶等[23]。不同制作工藝會使其化學成分遭到破壞,且茶多酚會不同程度被降解,如半發(fā)酵茶會破壞茶葉中的葉綠素,其茶多酚含量較未發(fā)酵茶葉中的低[37-38]。遵義紅茶相似度低可能與其是全發(fā)酵茶有關。此外,對于同品種、不同等級、不同廠家的茶葉進行研究,發(fā)現(xiàn)各個品種茶葉相似度在0.968～1.000,表明同一品種不同等級及不同廠家茶葉的品質較為接近,茶葉品質差異較小,其茶葉品質的差異主要取決于原料及發(fā)酵工藝等因素的影響。

對于33茶葉樣品進行聚類分析,結果表明,在標度為11時即分為3類,湄潭翠芽、鳳崗鋅硒茶、都勻毛尖、碧螺春、西湖龍井、天柱茶葉及綠寶石為一類,大紅袍與鐵觀音茶為一類,遵義紅茶為一類,其聚類結果與相似度分析結果基本一致。因此,通過對33批茶樣品進行聚類分析,可以區(qū)分發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶及未發(fā)酵茶三種不同發(fā)酵工藝的茶葉。本實驗通過建立不同品種茶葉HPLC指紋圖譜并結合聚類分析方法,可區(qū)分發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶及未發(fā)酵茶三種不同制作工藝的茶葉,并評價不同品種茶葉及同品種不同等級、不同廠家茶葉品質的差異,可為茶葉的質量控制和科學應用提供參考依據(jù)。