總狀毛霉與魯氏酵母耦合發酵對豆粕營養和風味的增強效應

張夢媛,張 雨,丁常晟,康 旭,袁江蘭

(湖北工業大學生物工程與食品學院,湖北武漢 430068)

豆粕是大豆油加工的副產品,其蛋白質含量超過40%,碳水化合物占10%～15%,并富含多種礦物質、維生素和必需氨基酸,是理想的蛋白質資源和動物飼料原料[1-4]。原料豆粕含有多種抗營養因子,如胰蛋白酶抑制劑、凝集素等,會造成動物幼仔胃腸功能紊亂或腹瀉,從而降低豆粕的生物利用率,使其營養價值得不到充分體現[5-7]。微生物發酵可以在很大程度上解決這一問題,同時微生物豐富的酶系還可將大豆蛋白、多糖等降解為多肽、氨基酸、低聚糖和單糖等,有效的生物轉化還可以產生更豐富的營養和風味成分,不僅有利于提高豆粕的營養價值和利用率,還能顯著提高其風味品質,改善其誘食性[7-8]。

發酵豆粕可直接用作動物飼料基料,合理的菌種耦合和發酵工藝所得產品甚至可以作為代乳類動物食品,不僅為動物幼崽提供合理的營養,而且具有提高生物利用率、增加誘食性、增強免疫力等作用。近年來有關菌種發酵豆粕的研究報道較多,例如,黑曲霉固態發酵使豆粕氨基酸含量提高了35.76%,粗蛋白增加了38.23%,胰蛋白酶抑制劑含量從1820降至480 TIU/mg[9];枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌混合發酵使豆粕氨基態氮含量提高了10.87倍,必需氨基酸含量提高了12.69%,胰蛋白酶抑制劑含量顯著降低,并且風味有所改善[10]。但是目前國內市場上這類產品還不夠成熟,現有產品在營養、風味、抗營養因子等方面還有很大的提升空間。菌種是發酵產品品質的決定性因素,通常將豆粕進行微生物發酵是為了降解其中的大分子蛋白和一些不易消化成分,毛霉有很好的產酶活性,可以有效降解大分子蛋白,但其發酵風味并不令人愉悅。魯氏酵母通常用于食品發酵,它可產生令人愉悅的發酵風味及色澤。將這兩種菌種耦合發酵豆粕,既可以使得豆粕中的大分子蛋白更好的得到降解,提高其消化吸收率,同時還可以解決發酵風味問題。

本文基于固態發酵,以毛霉為主要菌種,同時考察魯氏酵母耦合發酵及超聲前處理對發酵豆粕品質的影響,探究目標因素對發酵豆粕營養、風味品質的增強作用以及對胰蛋白酶抑制劑的清除效果,以期為豆粕代乳類動物飼料的研究和應用提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆豆粕 佳惠飼料有限公司;總狀毛霉(Mucorracemosus,菌種編號CICC40241)、孢子粉 沂水錦潤生物科技有限公司;魯氏酵母(菌種編號CICC32899) 湖北安琪酵母有限公司;胰蛋白酶1∶250(Trypsin)、胰蛋白酶抑制劑、苯甲酰-L-精氨酸-對硝基苯胺(L-BAPA) 阿拉丁上海有限公司;干酪素 上海源葉生物科技有限公司;β-疏基乙醇、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷[NH2C(CH2OH)3,Tris]、5-磺基水楊酸、冰乙酸(CH3COOH)、福林酚試劑 均為分析純試劑,國藥集團化學試劑有限公司。

LHS-150SC恒溫恒濕箱 上海齊欣科學儀器有限公司;K9860立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;L-8900全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司;DYY-8C電泳儀 北京六一有限公司;WFJ2000可見光分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 以原料豆粕(S1)為對照。

未前處理毛霉發酵豆粕(S2)的制備:按豆粕∶水=1∶1 (w∶v)的比例在豆粕中加入去離子水,充分攪拌均勻后于121 ℃滅菌20 min,冷卻后按照豆粕質量的0.20%接入毛霉孢子粉,攪拌均勻后置于28 ℃,濕度為50%～60%的恒溫恒濕箱中培養和發酵,取樣時間分別為0、12、24、36、48、60、72 h,所有樣品于50 ℃烘48 h,然后研磨并過60目篩備用。

超聲前處理毛霉發酵豆粕(S3)的制備:與S2同法滅菌冷卻后的豆粕,采用32 kHz、180 W超聲處理15 min后再進行接種發酵,后續操作同S2的制備。

超聲前處理毛霉和魯氏酵母混合發酵豆粕(S4)的制備:步驟同S3處理,只在接種時同時接入豆粕質量0.20%的毛霉孢子粉和0.10%的魯氏酵母。

1.2.2 可溶性蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍法[11-12]。分別取10 g發酵0、12、24、36、48、60、72 h的豆粕干粉樣品,加入200 mL蒸餾水,40 ℃水浴攪拌1 h,然后8000 r/min離心15 min,取上清液適度稀釋后測定。以自制牛血清白蛋白標準曲線為定量依據,標準曲線方程:y=0.0106x+00095(R2=0.9973)。

1.2.3 蛋白酶活測定 采用GB/T 28715-2012《蛋白酶活力的測定》中福林酚法測定蛋白酶活力[13]。與1.2.2同法獲得上清液,用pH7.5磷酸鹽緩沖液適度稀釋后測定中性蛋白酶活力。蛋白酶活力單位(U)定義為:40 ℃、pH7.5條件下每分鐘從可溶性酪蛋白中水解生成1 μg酪氨酸所需要的酶量。

1.2.4 感官評價 取10 g發酵60 h的鮮豆粕樣品置于潔凈培養皿中并隨機編號,隨機選擇12名的人員,將人員進行培訓后分為三組,對不同編號的樣品分別從色澤、質地、味道、氣味四個方面進行打分,每個項目滿分10分,總分40分,制定發酵豆粕感官質量評分標準如表1[14]。

表1 發酵豆粕感官質量評分標準表

1.2.5 SDS-PAGE分析 參照文獻[15]方法,取發酵60 h的豆粕S1、S2、S3、S4各2 g加入30 mL的0.01 mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)28 ℃水浴攪拌1 h,然后8000 r/min離心15 min獲得上清液,即為電泳上樣樣品。電泳上樣樣品按1∶1的比例加入含有巰基乙醇的上樣緩沖液煮沸5 min,待冷卻后10000 r/min離心2 min后將10 μL樣品添加到聚丙烯酰胺凝膠上(分離膠和濃縮膠濃度分別為12%和4%)。

1.2.6 胰蛋白酶抑制劑活性測定 精確稱取1.0000 g發酵60 h的發酵豆粕干粉(精確至0.0002 g),粉碎并過60目篩,加入50 mL 0.01 mol/L NaOH溶液,25 ℃水浴攪拌提取1 h,然后1.0 mol/L NaOH溶液調pH至9.5～9.8,繼續提取2 h,3500 r/min離心10 min后取上清液。將上清液用0.01 mol/L NaOH溶液稀釋80倍,得到樣品稀釋液。

吸取0.5 mL稀釋液于試管中,加入去離子水0.5 mL。再加入1.0 mL 37 ℃預熱的0.1 mg/mL胰蛋白酶溶液,混勻,最后加入2.5 mL 37 ℃預熱的1.0% BAPA溶液,混勻。混合液立即置于37 ℃水浴孵育10 min,加入0.5 mL 30%醋酸溶液終止反應。終止后的反應體系于10000 r/min離心15 min,測定410 nm處的吸光值得到樣品稀釋液的吸光值(A3)。另取0.5 mL稀釋液,加去離子水0.5 mL,加入2.5 mL BAPA溶液,然后加入0.5 mL醋酸溶液,混勻后于37 ℃保溫10 min,再加入1.0 mL胰蛋白酶溶液,10000 r/min離心15 min,測定410 nm處的吸光度值[16],得樣品稀釋液的空白吸光值(A4)。同法可得標準胰蛋白酶抑制劑的吸光值(A1)及其空白吸光值(A2),計算胰蛋白酶抑制劑活性。一個胰蛋白酶抑制劑活力單位定義為:在pH8.20、37 ℃條件下反應10 min,每10 mL反應混合物在410 nm處吸光值產生0.01單位的變化。

胰蛋白酶抑制活性(TIU/g)

式中:D:樣品提取液的稀釋倍數;m:樣品的質量(g);50:每克發酵豆粕樣品使用的0.01 mol/L NaOH的提取體積(mL);0.01:一個胰蛋白酶抑制劑活力單位是使酶反應產物光吸收值減少0.01。

1.2.7 氨基酸組成和含量測定 水解氨基酸測定:取發酵60 h的發酵豆粕干粉50 mg于20 mL安培管中,加入10 mL 6 mol/L HCl溶液,再加入1.0 g苯酚。充氮氣約5 min除去空氣,封管,110 ℃加熱水解24 h[17]。水解完成后,冷卻,搖勻,濾紙過濾,用超純水定量轉移至50 mL容量瓶,定容。取1 mL濾液于干凈培養皿中,60 ℃水浴蒸干水分,再加入約3 mL超純水,蒸干,重復1～2次以除去HCl,最后加入3 mL的樣品稀釋液攪拌均勻,0.22 μm濾膜過濾。氨基酸分析儀檢測其氨基酸組成和含量。

游離氨基酸測定:取上述樣品100 mg加入2 mL磺基水楊酸,混勻后靜置,然后15000 r/min離心15 min。取離心后上清液加入0.02 mol/L鹽酸溶液稀釋50倍,再用0.22 μm濾膜過濾,用氨基酸分析儀測定[18]。

1.2.8 味道強度值 氨基酸味道強度值(Taste active value,TAV)參考文獻[18]方法和公式計算。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 發酵豆粕蛋白酶活和可溶性蛋白的變化

由圖1可知,發酵12 h內,所有發酵樣品的蛋白酶活并無明顯提高,因為這一階段為毛霉孢子的萌發期及其新生菌絲的形成期;隨后蛋白酶活力迅速增加,并在60 h達到峰值,然后呈現緩慢下降的趨勢,這與毛霉菌絲的生長規律基本一致。發酵初期,各種條件適宜,菌絲生長和細胞增殖迅速。發酵后期,毛霉生長繁殖消耗了大量的營養基質,培養基水分含量下降,pH也發生相應變化,毛霉進入其生活史后期,菌絲開始分化產生孢子,逐漸停止產酶,因此蛋白酶活下降[19-20]。雖然發酵過程中蛋白酶的主要產生者是毛霉,但從S3和S4的比較可以看出,魯氏酵母對蛋白酶活也有一定貢獻,并且當發酵時間超過60 h以后產酶能力明顯下降。

圖1 豆粕發酵期間蛋白酶活和可溶性蛋白含量的動態變化規律

發酵豆粕可溶性蛋白含量的變化規律與蛋白酶活基本一致。發酵過程中大豆蛋白被酶水解,分子量減小,各種功能性質也會發生相應變化,最明顯的變化是蛋白質的溶解性。當大分子不溶性蛋白質逐漸降解,分子量減小,溶解性增加,因此可檢測到的可溶性蛋白含量增加,并且在60 h達到最大,但繼續發酵至72 h可溶性蛋白質含量均呈下降趨勢,這與可溶性蛋白的進一步降解有關。在發酵后期,隨著可溶性蛋白進一步降解而成為各種多肽、寡肽或氨基酸,因此檢測到的可溶性蛋白含量下降。可溶性蛋白質的變化規律與蛋白水解過程一致。

在所有取樣中,同一發酵時間的蛋白酶活力順序保持了高度一致:S4>S3>S2>S1,表明超聲前處理和雙菌種發酵在豆粕發酵中起到提高蛋白酶活力的作用。豆粕進行超聲前處理后的毛霉菌絲生長旺盛期(24～48 h)對蛋白酶活的影響顯著,發酵36 h,S3比S2的蛋白酶活增加了16.35%,可溶性蛋白增加了36.67%,48 h時酶活和可溶性蛋白分別增加了15.17%和36.26%。實驗中可以觀察到,S3中毛霉的生長狀況好于S2,表明超聲處理在一定程度上促進了毛霉的生長繁殖,這可能與超聲波對發酵原料豆粕的影響有關。由于超聲波處理在豆粕中產生的熱效應、機械效應和空化效應等,可能使豆粕的某些特性發生變化,包括豆粕蛋白質結構變化、豆粕樣品細胞變散、細胞破碎等,這些變化均會影響微生物對原料的利用,從而影響微生物的生長狀況[21]。因此也更有利于酶的產生和蛋白質的降解。相較于單菌種的毛霉發酵,毛霉和魯氏酵母雙菌種混合發酵對豆粕可溶性蛋白含量和蛋白酶活的提升效果均比較顯著。發酵60 h,S4較S3蛋白酶活增加了9.72%,可溶性蛋白含量增加了8.58%。由此可見,將豆粕進行超聲前處理和毛霉、魯氏酵母耦合發酵有助于豆粕發酵及其品質改良。

2.2 發酵豆粕的感官評分變化

發酵樣品的感官質量評分如圖2所示。由圖2可知,發酵豆粕四個方面的評分及總分均明顯高于未發酵豆粕。三種發酵豆粕S2、S3、S4均呈棕黃色,基質內外可見均勻分布的白色菌絲,有正常的豆粕發酵滋味和香氣,豆腥味消失。豆粕發酵過程中毛霉所產蛋白酶會水解蛋白質,造成風味成分的變化,如發酵過程中酪氨酸的分解可能會產生苯酚,影響風味;在毛霉發酵產物中,吲哚也是出現頻率較高的產物,它可能是由于色氨酸的裂解直接產生,低濃度的吲哚具有花香;毛霉發酵產生的酮類物質以苯乙酮為主,具有香甜氣味[22-23]。這些毛霉發酵代謝產物賦予發酵豆粕特有的滋味和香氣。

圖2 發酵豆粕的感官評分

S4的感官質量明顯優于S3和S2,表明魯氏酵母明顯有助于發酵豆粕感官品質的改良。魯氏酵母的主要作用是醇類發酵,并進一步合成多種酯類香氣成分、甘油和多元醇以及其他酮、酚等物質,在發酵產物的品質和感官評價中具有重要的作用[24-25]。魯氏酵母發酵最明顯的風味產物是4-乙烯基愈創木酚,它伴有發酵香氣,略帶甜味。因此,魯氏酵母耦合發酵豆粕,對豆粕產品的風味改善具有重要意義。

2.3 發酵豆粕蛋白SDS-PAGE分析

發酵豆粕水提上清液的SDS-PAGE結果如圖3所示。由S1的電泳結果可知,豆粕原料中可溶性蛋白主要包括7S和11S兩類抗原蛋白,其中7S抗原蛋白主要包括了三種亞基[26],分子量大于44.3 kDa。與未發酵豆粕S1進行比較可知,三種發酵豆粕的蛋白質均發生了明顯降解,44.3 kDa以上的蛋白條帶明顯變淡。

圖3 發酵豆粕水提液的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

S3、S4兩種發酵豆粕中7S蛋白條帶基本消失。11S蛋白的降解程度明顯低于7S蛋白,降解程度由高到低依次為S4、S3、S2。經過發酵,Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(KTI)所在位置的條帶也基本消失,表明大部分KTI發生降解,胰蛋白酶抑制劑活性基本消失。S3與S2、S4與S3的電泳結果也存在一定差異,說明豆粕超聲波前處理和魯氏酵母耦合發酵均對豆粕降解有利。

2.4 發酵豆粕胰蛋白酶抑制劑酶活分析

胰蛋白酶抑制劑是一種蛋白質類抗營養因子,可以在發酵過程中被微生物分泌的蛋白酶降解[17]。由圖4可知,豆粕發酵后胰蛋白酶抑制劑活力均顯著降低,與S1(4375 TIU/g)相比較,S2(675 TIU/g)、S3(400 TIU/g)、S4(350 TIU/g)分別下降了84.57%、90.86%和92.00%,說明發酵60 h后豆粕胰蛋白酶抑制劑基本失活,并且以S4的失活率最高。可見毛霉發酵極大程度消除了豆粕的抗營養因子。這與文獻[27]中微生物發酵豆粕降低胰蛋白酶抑制劑含量的結論具有一致性。另外,由差異顯著性分析可知,S2胰蛋白酶抑制劑活性顯著低于S1(P<0.05),而S3和S4的差異并不顯著,可知豆粕中胰蛋白酶抑制劑的清除主要依賴于總狀毛霉,而魯氏酵母的作用不明顯,由此可推斷,發酵豆粕中胰蛋白酶抑制劑活性的降低由蛋白質降解所致,由于毛霉的產蛋白酶能力強,因此有效地降低了胰蛋白酶抑制劑活性,而魯氏酵母蛋白酶產生能力弱,因此對于清除胰蛋白酶抑制劑作用不明顯。

圖4 發酵豆粕的胰蛋白酶抑制劑活力

2.5 發酵豆粕氨基酸組成和含量變化規律

經微生物發酵后,豆粕的大多數氨基酸組成和含量發生顯著變化,從而影響了豆粕的營養和感官品質。發酵豆粕水解氨基酸含量變化如表2所示,發酵豆粕總氨基酸含量顯著增加,S2、S3、S4比S1分別增加了13.64%、15.23%和22.92%;發酵后必需氨基酸含量顯著增加,S2、S3、S4含量分別為102.05、103.41、109.64 mg/g,較S1(96.71 mg/g)分別提高了5.52%、6.93%和13.37%,其中菌種耦合發酵對總氨基酸和必需氨基酸的增量作用顯著,而超聲前處理的影響并不顯著。三種發酵豆粕的必需氨基酸總量均達到總氨基酸含量33%以上,說明毛霉發酵豆粕可以為動物幼仔提供更合理而豐富的氨基酸營養。

表2 發酵豆粕水解氨基酸組成和含量(mg/g)

發酵豆粕游離氨基酸的來源主要包括兩個方面:一是,豆粕蛋白高溫變性后,在發酵過程中微生物蛋白酶的作用下逐漸降解為游離氨基酸[28];二是微生物通過生物轉化合成游離氨基酸。由表3可知,原料豆粕S1中游離氨基酸含量較少,總游離氨基酸量僅為13.37 mg/g,但經過發酵,含量顯著增加,S2、S3、S4分別是S1的5.65、6.24、7.69倍,其中S2、S3、S4必需氨基酸含量分別為17.08、18.86、22.44 mg/g，較S1(3.62 mg/g)分別增加3.72、4.21、5.20倍。總體比較,發酵豆粕的滋味顯著優于未發酵豆粕,但雙菌種發酵對豆粕游離氨基酸含量的提升作用更加顯著,綜合品質改良也更加有效。毛霉和魯氏酵母耦合發酵使豆粕蛋白發生顯著降解,產生了豐富的游離氨基酸,不僅可以有效提高豆粕的營養價值,提高動物幼仔對豆粕消化吸收率[29],還可以很大程度改善豆粕的感官品質,有利于提高動物的誘食性。但超聲前處理的作用并不顯著。

表3 發酵豆粕游離氨基酸的組成和含量(mg/g)

2.6 發酵豆粕游離氨基酸對風味品質的影響

部分游離氨基酸能呈現不同味道,因此成為食品中重要的呈味物質[30],如食品鮮味主要來源于天冬氨酸和谷氨酸,甜味主要來源于丙氨酸和甘氨酸等[18,31]。發酵豆粕的游離氨基酸呈味強度如表4所示。發酵豆粕中S4的鮮味氨基酸TAV值最大,達到87.39,鮮味強度是原料豆粕的11.99倍,其中谷氨酸是主要的貢獻鮮味的氨基酸,是發酵豆粕鮮味形成的重要成分,而S2、S3的鮮味氨基酸的呈味強度分別是S1的9.44、9.61倍。這一結果說明毛霉和魯氏酵母混合發酵對發酵豆粕鮮味提升效果最好,明顯強于毛霉單菌種發酵豆粕,但超聲前處理的影響不顯著。

表4 發酵豆粕游離氨基酸呈味強度

甜味氨基酸的呈味強度相對較低,S2、S3、S4的游離氨基酸甜味呈味強度分別是原料豆粕S1的5.72、6.31、8.49倍,其中丙氨酸對發酵豆粕甜味貢獻最大。S4甜味氨基酸的TAV值明顯高于S2、S3,說明魯氏酵母對提高發酵豆粕的甘甜味具有顯著作用,但前處理作用不顯著。同時還應注意發酵豆粕的苦味氨基酸含量也顯著增加,S2、S3、S4的游離氨基酸苦味呈味強度分別是原料豆粕S1的4.77、5.25、4.57倍,其中S4的苦味強度低于S2、S3,表明毛霉和魯氏酵母雙菌種發酵對發酵豆粕的滋味有明顯的改良作用。苦味常常給食品帶來不良的味覺感受,雖然發酵后各種呈味氨基酸的呈味強度均顯著增強,但鮮味和甜味強度的增幅顯著高于苦味強度,因此發酵豆粕的呈味得到顯著改善。綜合分析,S4的呈味感受最佳。

3 結論

本文以毛霉為主要菌種發酵豆粕,旨在改良豆粕營養和風味,以獲得營養豐富、營養抗性低、感官品質優良、誘食性好的動物代乳食品原料。結果表明高產蛋白酶的毛霉與魯氏酵母相耦合,可使豆粕營養物質含量增加、抗營養因子胰蛋白酶抑制劑基本消除,并且風味得到明顯改良,可有效實現豆粕品質優化的目標。超聲前處理也有利于發酵并對發酵豆粕品質有提高作用,但效果并不顯著。綜合分析認為,毛霉和魯氏酵母耦合發酵豆粕能顯著改良豆粕品質和風味,為發酵豆粕的進一步研究和應用提供了參考。