魔芋寡糖的膜分離及產物組成分析

唐湘華,楊云娟,顧天坤,慕躍林,吳 倩,黃遵錫,*

(1.云南師范大學生物能源持續開發利用教育部工程研究中心,云南昆明 650500;2.云南省酶工程技術研究中心,云南昆明 650500;3.云南師范大學生命科學學院,云南昆明 650500)

魔芋是天南星科魔芋屬中具有球莖的多年生草本植物,廣泛分布在中國的云南、貴州、四川、湖北、安徽、河南等地[1-2]。魔芋中含有大量的葡甘露聚糖[3-4],為天然高分子化合物,具有較好的黏性,能與水結合成膠體溶液[5-6],可用于食品穩定劑[7-8]、增稠劑[9]、膠凝劑[10-11],益生菌的包埋劑[12-13]等。魔芋寡糖是一類由2～20個單糖聚合而成的聚糖混合物[14-15],是從魔芋原料中提取的產物。魔芋寡糖的制備通常采用酸法、酶法或者微波法獲得[16-18]。酶法水解是反應比較溫和的常用方法,采用β-甘露聚糖酶水解低濃度魔芋粉進行制備,而高溶質濃度魔芋粉水解能提高生產效率,降低生產成本,能獲得高收率的寡糖,但高濃度魔芋精粉進行酶法水解會導致溶液中出現高濃度粗纖維、溶液粘度大,形成高濃度渾濁懸浮液,不利于后處理。因此,如何快速、高效的從水解液中分離獲得寡糖產品,一直是當前工藝分離的熱點,而采用梯度逐級分離寡糖形成單一產品是將來發展的核心。

膜過濾是現代用于分離、濃縮的一類新型的生物技術,如白酒過濾除雜、去除異味[19]、醬油調味液的過濾[20]、谷氨酸[21]的過濾、多糖的分離與純化[22]、藥物的分離[23]、食品飲料行業[24-25]等都有所應用,其使用范圍遍及各個行業。由于膜過濾的能耗低,效率快,目前已被廣泛應用于各個行業。魔芋寡糖是一類具有黏性、濃度高的小分子聚糖,其分子量在342～3300 Da之間,要進行分離常采用離子交換法[26]、凝膠過濾分離[27],但工業化程度低;膜過濾[28]是一類能耗低、損失小、溫和型的分離方法,適合用于工業化生產。多級膜過濾串聯能實現逐級過濾分離,可用于黏度低、溶質物低的生物活性物質溶液的分離,但用于魔芋寡糖分離的研究報道較少。本研究采用高速離心機,結合微孔陶瓷膜、超濾膜和超濾膜的組合,探索在高濃度魔芋水解產物的分離、純化、濃縮的應用,為功能糖的開發應用提供可行性依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魔芋精粉(85%純度的一級粉) 麗江玉元食品有限公司提供;酸性甘露聚糖酶(20000 U/g) 昆明愛科特生物科技有限公司生產。

定制型200L不銹鋼酶解罐 云南寶泰輕化機械有限公司;WDR0.06-0.7全自動小型電加熱蒸汽鍋爐 上海華征特重鍋爐制造有限公司;8WDH-604高速離心分離機 南京綠島機械設備有限公司;SJM-MF-3.4無機陶瓷膜過濾設備 合肥世杰膜工程有限責任公司;4040型超濾、納濾實驗一體機(有機超濾膜分子量5000 Da,有效膜面積7 m2,有機納濾膜分子量100 Da,有效膜面積37 m2) 江蘇無錫偉爾生化設備廠;TGL-16B高速離心機 上海安亭科學儀器廠;UV-5100紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;WAY-2w阿貝折光儀 上海光學儀器廠;NDJ-5S數顯黏度計 上海平軒科學儀器有限公司;CJJ-931四聯磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀 德國布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魔芋寡糖的水解制備 圖1為魔芋寡糖水解制備工藝,在酶解罐a中加入100 kg純凈水,加熱到60 ℃,添加內切型β-甘露聚酶使水溶液中的酶活力為50 U/mL。稱取12.5 kg一級魔芋精粉b,緩慢加入到酶解罐中(10 min內完成),邊水解邊混合,形成的水解溶液低于100 cP;然后繼續加入12.5 kg魔芋精粉(10 min內完成),該階段由于起始酶蛋白濃度高,酶解速度快,水解液中的黏度都很低,隨著溶質增多,單位酶蛋白催化水解的葡甘露聚糖變多形成過飽和狀態,需要不斷攪拌混合酶解1 h,使溶液黏度降低到50 cP時結束酶解過程;間接升溫使酶解罐中的水解液溫度達到80 ℃,保溫10 min終止酶解反應,再通入冷卻水使溶液冷卻到45 ℃,利用酶解罐底部的初級篩網對反應體系中的粗纖維進行過濾截留,獲得粗濾液c;使用轉數8000 r/min的碟片式離心機分離去除初級過濾液c中的淀粉、小分子纖維、懸浮物,獲得離心過濾液d;再把離心過濾液d經過0.2 μm孔徑的無機陶瓷膜組件進行微孔過濾,去除廢渣、蛋白及大分子多聚糖,獲得陶瓷膜過濾液e;陶瓷膜過濾液e通過超濾膜組件后得超濾透過液f,超濾透過液f再經過納濾膜過濾得到納濾濃縮液g,經噴霧干燥后獲得粉劑產品h。

圖1 魔芋寡糖制備工藝流程圖

1.2.2 酶法水解液黏度變化分析 當魔芋精粉加入到酶解罐中進行酶法水解,每隔5 min取水解液樣品500 mL,使用轉子黏度計測定黏度。

1.2.3 高濃度魔芋水解液對膜過濾通量的影響

1.2.3.1 陶瓷膜過濾 用轉數8000 r/min的碟片式離心機分離去除粗濾液c中的淀粉、粗纖維,獲得離心液d,再把離心液經過0.2 μm孔徑的無機陶瓷膜組件(操作壓力為0.3 MPa,循環溶液的溫度上限控制在50 ℃),通過不斷循環使濃縮液的透過液糖度低于10 g/L時,結束操作,收集透過膜的溶液即為陶瓷膜過濾液e。

1.2.3.2 超濾膜過濾通量測定 實驗收集了寡糖濃度為150 g/L的微孔透過液e進行超濾膜的過濾通量測試,分析膜過濾技術對粘性寡糖溶液分離的可行性,選用的超濾膜組件能對分子量大于5000 Da的聚糖大分子、蛋白和生物堿等物質進行截留篩分。實驗操作過程中,泵的工作壓力為0.3 MPa,溶液的溫度上限控制在50 ℃,每隔5 min測定透過液的重量和溶液中的寡糖含量,計算超濾膜的過濾通量、寡糖濃度和寡糖回收率。

1.2.3.3 納濾膜過濾通量測定 把洗超濾膜的透過濾液和超濾透過液f進行收集后得到112 g/L的寡糖溶液,作為納濾膜過濾的初始濃度進行測試納濾膜的通透性和濃縮效應。在納濾膜操作壓力為1.3 MPa,溶液溫度控制在50 ℃以下的條件下進行濃縮過濾,每隔5 min測定透過液m廢水的重量和廢水中還原糖，計算納濾膜過濾通量;同時測定濃縮液e中的寡糖濃度。

1.2.4 指標的測定

1.2.4.1 魔芋寡糖的測定 分別取超濾液f 和納濾濃縮液e 0.2 mL滴在阿貝折射儀樣品倉中,測定超濾液f和納濾濃縮液e溶液中的總糖含量;再分別稀釋超濾液f和納濾濃縮液e樣品25倍,分別取2 mL稀釋液到試管中,向試管中加入3 mL入DNS試劑,混合,沸水浴5 min,冷卻,每支試管加入10 mL單蒸水,混合均勻,在波長540 nm處,比色測定OD,通過下面公式計算還原糖含量。

式中:0.894表示甘露糖標準曲線的斜率;0.017為標準曲線的截距;25表示溶液的稀釋倍數;0.2表示取樣量,mL。

魔芋寡糖含量=總糖含量-還原糖含量

1.2.4.2 膜過濾通量的測定

式中:J表示寡糖溶液的過濾通量,kg/h·m-2;m表示膜透過液的重量,kg;t表示過濾時間,h;S表示過濾膜的面積,m2。

1.2.4.3 寡糖的回收率測定

魔芋寡糖的回收率η(%)=(濃縮液中的寡糖濃度×過濾后溶液總體積)/過濾時溶液中的寡糖含量×總體積×100

1.2.4.4 魔芋寡糖組成成分的MALDI-TOF-MS分析 對魔芋寡糖的濃縮液樣品稀釋到5倍,使溶液中的寡糖濃度為40 g/L,取樣品和2,5-二羥基苯甲酸(DHB)基體溶液按照1∶1稀釋后混合在MALDI板上,室溫干燥,使用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀MALDI-TOF/TOF進行分析寡糖的組成。儀器使用MALDI離子化,每個質譜共獲得10000～20000次激光發射,質譜采用陽離子模式下的超光譜MALDI-TOF/TOF Bruker質譜儀采集。

1.3 數據處理

使用Excel 2010對測定值進行計算,使用Origin 8.5軟件對數據進行統計分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 酶法水解高濃度魔芋粉的制備液黏度變化分析

圖2為β-甘露聚糖酶水解魔芋精粉的水解液黏度變化曲線圖,實驗過程分兩次添加魔芋粉,最終溶液中的魔芋粉濃度為250 g/L (w/v)。當12.5 kg魔芋精粉第一次加入到50 U/mL的酶溶液中,形成的濃度為125 g/L,酶蛋白的催化水解效應極大的降低了魔芋精粉的吸水系數,導致酶解液的黏度較低,維持在100 cP;當第二次添加魔芋粉,導致水解液的黏度快速升高到1000 cP,隨著酶解反應時間的延長,寡糖制備液中的黏度在90 min時降到50 cP左右,溶液的流動性較好,有利于管道的輸送。

圖2 250 g/L的魔芋粉水解液的黏度變化曲線

2.2 魔芋寡糖的分離

2.2.1 魔芋寡糖對超濾膜過濾的影響 魔芋寡糖是一類小分子聚糖的混合物,包含2～20個糖環的聚合體,分子量在342～3300 Da內[27]。采用酶法水解高濃度魔芋精粉,通過控制酶解液的黏度和聚合度,定向控制葡甘露聚糖的水解程度,制備不同組合的魔芋寡糖。由于實驗使用了高濃度水解工藝,魔芋精粉沒有被充分水解,大分子聚糖和魔芋中的纖維導致水解液黏度高,膜的表面阻力大,過濾通量降低。圖3為超濾膜過濾魔芋粉水解液的通量和回收率的變化情況,在溶劑以水為參比的條件下,超濾膜的過濾通量為25.2 kg/h·m-2,而在含有150 g/L濃度的寡糖的初始過濾通量為7.02 kg/h·m-2,90 min后,過濾通量只有4.45 kg/h·m-2,過濾效率相比于初始時下降了37%;通過對比溶劑的過濾通量發現,透過液中的寡糖濃度隨時間的延長而增加,而超濾膜的過濾通量在降低,表明水解糖溶液中的溶質嚴重影響著超濾膜的過濾通。寡糖濃度隨著過濾時間的延長在不斷的增高,表明聚合度低的寡糖和溶劑水優先進入透過液,聚合度高的寡糖分子排在后面,導致前期寡糖濃度低,后期濃度增高;而寡糖回收率η也隨著透過液的增多而增加,當過濾時間為90 min時,寡糖的回收率η達到86.7%,表明利用超濾膜處理寡糖的工藝路線是可行的。

圖3 寡糖對超濾膜過濾通量和回收率的影響

2.2.2 寡糖對納濾濃縮的影響 圖4分析了納濾膜的濃縮效應,由于選用的納濾膜截留分子量較小,大量的溶劑水、有機酸、小分子的物質和金屬離子被帶走,寡糖分子被截留下來,溶液中寡糖濃度被不斷提高,通過超濾和納濾的分子篩效應形成高濃度的寡糖溶液,能達到187 g/L濃度。從納濾通量的曲線圖可以看出,以水為過濾介質的通量能達到6.45 kg/h·m-2,而在寡糖濃縮廢液過濾通量的測試中,隨著溶質濃度增高,納濾的初始過濾通量由2.51降到0.6 kg/h·m-2,表明寡糖濃度越高,納濾的過濾通量越低。考慮納濾膜的滲漏現象,在對廢水的測定中發現沒有還原糖的存在,表明該濃縮技術路線是可行的。

圖4 寡糖對納濾膜過濾通量的影響

2.3 魔芋寡糖成分分析

為了解寡糖的構成比例關系,利用MALDI-TOF-MS進行分析,在圖5A中可以看出,從魔芋寡糖的一級質譜圖中的碎片峰推斷可以看出甘露糖的二聚體到二十聚體都能被檢測到,每個糖分子離子碎片峰的差值顯示了每個聚糖分子之間相差分子量為162或者162的倍數,而162為單糖脫水形成糖苷的分子量。圖譜中的碎片峰對應的分子量為[M+K]+,對應峰的相應糖分子已標注在圖,膜分離的產品能檢測到二十糖。根據峰面積的比例關系,對寡糖的組成進行了計算,如圖5B所示,寡糖產物中以三糖比例較高,達到了21.5%,二糖～十四糖的占比為90%,十五糖～二十糖的比例為9%。

圖5 魔芋寡糖的MALDI-TOF-MS分析

3 結論

本文通過膜技術進行寡糖的分離、純化、濃縮,膜的過濾通量及產品組成的分析。結果表明:采用膜過濾技術用于魔芋寡糖分離、提純和濃縮工藝是可行的。使用濃度150 g/L的寡糖溶液通過超濾膜過濾,溶質濃度低的溶液過濾通量大,但隨著過濾時間的延長,通量出現降低;過濾通量能維持在7.02～4.45 kg/h·m-2,寡糖回收率在90 min時能達到86%以上。納濾膜過濾通量隨著可溶性聚糖的濃度的增加而降低,溶質濃度越低過濾通量越大。通過對100～5000 Da的魔芋寡糖混合物進行基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)分析,結果表明寡糖的構成比例中以三糖為主,含量為21.5%。二糖～十四糖的總含量達到90%,十五糖～二十糖的含量為9%。

在超濾提純工藝中,為了避免因糖濃度過高而出現溶液的通量迅速下降的現象,應對寡糖液進行初步預處理,采用陶瓷膜微孔洗濾、高速離心過濾去除大部分纖維雜質和較大分子量多糖,增加過濾效率。寡糖溶液在超濾過程中產生較大阻力,但流體特性比較好,過濾通量隨溶質濃度而發生變化,溶質濃度高,濃差極化現象嚴重,過濾通量小;在濃度低的寡糖溶液,濃差極化弱,過濾通量快,因此在高濃度水解產物中適當進行稀釋,能加速超濾的回收率。

納濾膜能承受較高壓力,通過提高操作壓力能加速溶劑水的過濾,提高濃縮液中寡糖的含量。提高操作壓力中將會對納濾的錯流操作模式變為常規擠壓模式,容易導致膜表面形成的溶質層較厚,大量的寡糖存儲在膜的表面,后期需要加水沖洗納濾膜表面,以獲得高的產品回收率。

直接采用魔芋粉進行酶法水解的溶液中,由于糖苷水解酶的專一性,形成的產物種類單一,產物為六碳糖的聚體混合物,通過膜過濾處理后對膜的污染程度進行常規的堿洗后發現,該濾膜能保持正常的過濾通量,糖類物質對濾膜的污染程度較低,使用濾膜過濾魔芋寡糖是完全可行的。