裂葉蕁麻體外降糖活性化學成分

楊文娟,胡 媛,毛跟年,何亞娟,侯景龍,馬養民

(1.陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安 710021;2.陜西科技大學化學與化工學院,教育部輕化工助劑化學與技術重點實驗室,陜西西安 710021)

裂葉蕁麻(UrticafissaE. Pritz.)為蕁麻科蕁麻屬多年生草本植物,始載于《本草圖經》,是常用的民族藥和民間藥[1],又叫蜇人草、蝎子草等,在我國西北、西南等地分布十分廣泛[2],具有祛風除濕、活血止痛、降血糖等功能,其莖皮纖維可供紡織用,葉和嫩枝煮后可作為飼料[3]。目前國內外關于蕁麻屬植物的根、莖、葉、種子等不同部位的化學成分有較多研究,王夢月等[4-6]研究了裂葉蕁麻根、葉的化學成分,Zhang等[7]研究了裂葉蕁麻種子中具有細胞毒性的化學成分,何斌[8]用HPLC法檢測了異株蕁麻莖中的綠原酸和黃酮類化合物等,表明蕁麻屬植物含有黃酮、木脂素、有機酸、甾體、揮發油、多糖類等化合物[9-12]。此外,蕁麻屬植物具有良好的抑制良性前列腺增生、抗風濕、降血糖、鎮痛、抗炎、抗菌、抗氧化等藥理活性[13-16],蕁麻屬植物降血糖活性成為近年來的主要研究熱點之一,Mehri等[17]從多個數據庫中篩選出21篇文章,分析了蕁麻水提物或醇提物在治療糖尿病中的療效和安全性,表明使用蕁麻可顯著降低血糖和糖尿病并發癥。裂葉蕁麻乙醇提取物對鏈脲佐菌素誘導糖尿病小鼠的肝臟、腎臟損傷的作用,發現其保護作用與抗氧化活性相關[18-19]。

糖尿病是一種慢性內分泌代謝紊亂疾病,發病率呈逐年上升的趨勢。研究發現,機體長期的高血糖會引起糖尿病腎病、糖尿病足、糖尿病性腦血管病等并發癥,而避免和控制糖尿病并發癥的最佳方式就是控制血糖,控制血糖有多種途徑,減少體內淀粉類物質分解為單糖的速度、降低餐后血糖就是臨床常用方法之一[20]。α-葡萄糖苷酶在食物碳水化合物的代謝過程中發揮著重要的作用,它能促進淀粉、蔗糖、麥芽糖等分解為單糖,抑制α-葡萄糖苷酶能夠減少單糖的產生,從而降低餐后血糖[21-22]。因此,對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究為評價體外降糖活性的常用研究方法。從中藥或天然植物中篩選降糖活性成分如小檗堿、葛根素、黃芪多糖等具有明確的調節血糖血脂作用,臨床用于緩解糖尿病及其并發癥[23-25]。除了從傳統中藥篩選外,其他天然植物如木樨欖葉、鷹嘴豆、綠蘿花等也進行了化學成分及降糖活性研究[26-28]。

目前蕁麻主要集中于水提物或醇提物的降糖活性研究[29-30],而其降糖的物質基礎鮮有報道。因此,本研究以α-葡萄糖苷酶的抑制作用為追蹤手段,篩選裂葉蕁麻體外降糖活性部位,并分離鑒定其化學成分,明確具有體外降糖活性的化合物。以期為闡明裂葉蕁麻治療糖尿病的物質基礎,也為開發該植物資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裂葉蕁麻 采自陜西省旬陽縣,經陜西中醫藥大學顏永剛教授鑒定為蕁麻科蕁麻屬植物裂葉蕁麻(UrticafissaE.Pritz.);α-葡萄糖苷酶(23.5 U/kg)、阿卡波糖、對硝基苯酚(pNP)、對硝基苯-α-D葡萄糖吡喃苷(pNPG) 上海源葉生物科技有限公司;二甲基亞砜(DMSO) 天津市科密歐化學試劑有限公司;柱層析色譜硅膠 青島海浪硅膠干燥劑有限公司;其他試劑 均為分析純。

全波長掃描式多功能讀數儀 賽默飛世爾科技有限公司;BrukeravanceⅢ-400MHz超導核磁共振儀 瑞士Bruker公司;XW-80A渦旋混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;XT5顯微熔點分析儀 北京市科儀電光儀器廠;HH-4數顯恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠;JA26038電子天平 上海天美天平儀器有限公司;RE-52A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 pNP標準曲線的繪制 精確稱取0.0014 g pNP標準品,用PBS(磷酸鹽緩沖溶液,0.1mol/L,pH=6.7)溶液超聲溶解,定容至10 mL容量瓶中,得濃度為0.001 mmol/L的pNP母液,將其稀釋成一系列濃度為1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.016 mmol/L的溶液。分別取以上不同濃度的pNP溶液各100 μL加入96孔板,再加入1 mol/L的Na2CO3溶液100 μL,振蕩10 s后,在波長405 nm處測定其吸光度,每組濃度平行測定三次,求其平均值。以吸光度為縱坐標,以pNP摩爾濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

1.2.2 裂葉蕁麻提取部位的篩選 將裂葉蕁麻植株分為根、莖、葉三部分,陰干使其含水量在5%之內,取根、莖、葉各200 g,粉碎,過60目篩,用10倍量70%乙醇浸提3次,每次2 h,合并提取液,在0.1 MPa,65 ℃下減壓濃縮成浸膏,65 ℃干燥至恒重,備用。分別精密稱取根、莖、葉干浸膏0.1000 g,用DMSO溶解配成10 mg/mL的母液,并分別稀釋成一系列濃度為1、2、4、6、8、10 mg/mL的溶液,陽性對照阿卡波糖與樣品配制成相同的濃度梯度,并檢測α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.3 裂葉蕁麻乙醇提取物不同溶劑萃取相的篩選 選擇體外活性較高的裂葉蕁麻部位進行化學成分的初步分離,取其粗粉3 kg,用10倍量70%乙醇浸提3次,每次48 h,每隔8 h攪拌一次,合并提取液,在0.1 MPa 65 ℃下減壓濃縮成浸膏,65 ℃干燥至恒重,得到醇提物干浸膏260.58g,然后將其懸浮于水中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,分別減壓回收溶劑,得到石油醚相浸膏20.00 g,乙酸乙酯相浸膏13.63 g,正丁醇相浸膏127.50 g,水相(萃余部分)浸膏76.37 g。分別精密稱取以上四相浸膏0.1000 g,用DMSO溶解配成10 mg/mL的母液,并分別稀釋成一系列濃度為1、2、4、6、8、10 mg/mL的溶液,陽性對照阿卡波糖與樣品配制成相同的濃度梯度,并檢測α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.4 化學成分的分離及結構鑒定 選擇體外活性較高的萃取相進行化學成分分離,取該萃取相濃縮后的浸膏13.00 g,用90 mL甲醇溶解,25.00 g硅膠拌樣,在80 ℃的烘箱中放置24 h至恒重,經硅膠柱層析,石油醚-乙酸乙酯(100∶0、100∶10、100∶20、100∶50、100∶100)、乙酸乙酯-甲醇(100∶0、100∶10、100∶20、100∶50、0∶100)梯度洗脫,每個梯度設置6個洗脫體積,采用重結晶來進行分離純化,石油醚∶乙酸乙酯=100∶10的第5個洗脫體積經重結晶得到化合物1(15.4 mg)、石油醚∶乙酸乙酯=100∶20的第1個洗脫體積經重結晶得到化合物2(7.7 mg)、石油醚∶乙酸乙酯=100∶20的第2個洗脫體積經重結晶得到化合物3(13.34 mg)和4(20.50 mg)、石油醚∶乙酸乙酯=100∶20的第2個洗脫體積經重結晶得到化合物5(10.23 mg),乙酸乙酯洗脫梯度的第6個洗脫體積經重結晶得到化合物6(20.39 mg),結合理化性質,通過1H-NMR、13C-NMR等方法對所得化合物的結構進行鑒定。

1.2.5 化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制率 分別精密稱取6個化合物0.0050 g,DMSO溶解配成1 mg/mL的母液,并分別稀釋成一系列濃度為1、2、4、6、8、10 mg/mL的溶液,陽性對照阿卡波糖與樣品配制成相同的濃度梯度,并檢測α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制率的測定 本實驗參照Jeon等[31]的方法,選定200 μL的反應體系,首先在96微孔板中加入10 μL的樣品溶液,再加入40 μLα-葡萄糖苷酶(0.5 U/mL),迅速放入37 ℃微孔板恒溫振蕩器中孵化10 min,然后在反應混合物中加入50 μL的底物溶液(pNPG),迅速放入37 ℃微孔板恒溫振蕩器中反應30 min。反應結束后加入100 μL終止液來終止反應,于405 nm波長處測定其吸光度。以阿卡波糖作為陽性對照,加樣方法如表所示(表1),每組3孔,按式1計算α-葡萄糖苷酶的抑制率,并計算其半數抑制濃度(IC50)。

表1 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定的加樣量(μL)

隨著我國社會的不斷發展，我國經濟增長的速度越來越快。在過去的發展歷程中，我國很多經濟增長是以環境的破壞為代價而取得的，在近些年，環境保護已經成為了我國新的發展重心。隨著我國對于環境保護和生態建設的重視度越來越高，林業發展成為了人們關注的重點，本文針對林木種苗的現現狀進行了闡述，并對其培育技術和管護要點進行了分析。

式中:A1為樣品組的吸光度;A2為樣品背景組的吸光度;A3為空白對照組的吸光度;A2為空白對照背景組的吸光度。

1.3 數據處理

實驗重復3次,采用Origin 8.0及SPSS 24.0對數據進行分析,結果用平均數±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 pNP標準曲線

pNP的標準曲線見圖1,得到回歸方程為y=0.0009x+0.0552,R2=0.998,說明pNP在0.016～1.000 mmol/L濃度范圍內具有良好的線性關系。

圖1 pNP標準曲線

2.2 裂葉蕁麻提取部位的降糖活性篩選

由α-葡萄糖苷酶抑制活性測定結果可知(圖2),裂葉蕁麻不同部位對α-葡萄糖苷酶均有一定抑制作用,但作用強度有差別,根、莖、葉的IC50值分別為11.809、12.402、20.169 mg/mL,由此可見,其抑制活性強弱順序為根>莖>葉,裂葉蕁麻根的抑制作用最強,因此,后續研究對裂葉蕁麻根進行體外活性部位的篩選。

圖2 裂葉蕁麻不同部位對α-葡萄糖苷酶的抑制率

2.3 裂葉蕁麻乙醇提取物不同溶劑萃取相的降糖活性篩選

由α-葡萄糖苷酶抑制活性測定結果可知(圖3),裂葉蕁麻根不同極性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制作用有明顯差別,其中,石油醚相對α-葡萄糖苷酶幾乎沒有抑制作用,乙酸乙酯相、正丁醇相和水相對α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值分別為8.499、13.241、19.774 mg/mL,由此可知,萃取相對α-葡萄糖苷酶抑制活性強弱順序為乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>石油醚相,乙酸乙酯相的抑制作用最強,因此,對裂葉蕁麻根乙酸乙酯相的化學成分進行系統分離及活性成分鑒定。

圖3 裂葉蕁麻根不同極性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制率

2.4 化合物的結構鑒定

化合物1:白色針狀結晶,ESI-HR-MS:576.43518[M+H]+,分子式為C35H60O6,mp297～299 ℃,1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δH:5.34(1H,d,J=5.0 Hz,H-6),3.52(1H,s,H-3),1.01(3H,s,H-19),0.92(3H,s,H-21),0.70(3H,d,J=6.4 Hz,H-18),13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δC:140.37(C-5),121.76(C-6),71.83(C-3),56.75(C-14)、56.01(C-17)、50.10(C-9)、45.79(C-24)、42.27(C-13)、40.56(C-4)、37.24(C-12)、36.51(C-1)、36.16(C-10)、33.92(C-20)、31.89(C-22)、31.64(C-8)、29.09(C-7)、28.28(C-2)、24.32(C-23)、27.23(C-25)、25.98(C-16)、23.01(C-15)、21.08(C-28)、19.86(C-11)、19.43(C-26)、19.43(C-27),19.03(C-19)、18.79(C-21)、12.00(C-18)、11.88(C-29)。以上數據與文獻[32]報道基本一致,故鑒定為對β-谷甾醇。

化合物2:白色粉末,ESI-HR-MS:179.07028[M+H]+,分子式為C10H10O3,mp 216～218 ℃,1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δH:7.67(1H,d,J=15.9 Hz,H-β),7.46(2H,d,J=8.2Hz,H-2,H-6),6.88(2H,d,J=8.2 Hz,H-3,H-5),6.33(1H,d,J=15.9 Hz,H-α),3.83(1H,S,-OCH3)。13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δC:168.03(C=O)、157.70(C-4)、144.67(C-β)、130.02(C-3、C-5)、127.19(C-1)、115.89(C-2、C-6)、115.18(C-α)、51.75(-OCH3)。以上數據與文獻[33]報道基本一致,故鑒定為對羥基桂皮酸甲酯。

化合物4:白色粉末,ESI-HR-MS:137.05972[M+H]+,分子式為C8H8O2,mp-2～-1 ℃,1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δH:7.81(2H,d,J=8.5Hz,H-2,H-6),6.97(2H,d,J=8.2Hz,H-3,H-5),3.81(3H,s,H-OCH3),9.84(1H,s,H-CHO)。13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δC:191.54(C-1)、162.68(C-4)、132.57(C-2、C-6)、130.01(C-CHO)、116.07(C-3、C-5),51.78(C-OCH3)。以上數據與文獻報道[35]基本一致,故鑒定為對甲氧基苯甲醛。

化合物5:白色粉末,ESI-HR-MS:165.05449[M+H]+,分子式為C9H8O3,mp 210～212 ℃,1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δH:7.53(2H,d,J=5.0Hz,H-2,H-6),6.79(2H,d,J=5.0 Hz,H-3,H-5),6.30(1H,d,J=15.9 Hz,H-α),7.50(1H,d,J=12.3Hz,H-β),根據耦合常數判斷為反式雙鍵,并且該雙鍵和吸電子基團相連。13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δC:168.46(COOH)、125.70(C-1)、144.68(C-β)、160.05(C-4)、115.75(C-α)116.19(C-3、C-5)、130.59(C-2,C-6)。以上數據與文獻[36]報道基本一致,故鑒定為反式-對羥基肉桂酸。

化合物6:白色粉末,ESI-HR-MS:576.43518[M+H]+,分子式為C35H60O6,mp 297～299 ℃,1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6),δH:5.34(1H,m,H-6),4.91(1H,H-1′),4.47(2H,t,J=11.50 Hz,H-6′),4.21(1H,d,J=7.70 Hz,H-4′),3.09(1H,m,H-3),0.99(3H,H-21),0.96(3H,H-19),0.91(3H,d,J=6.30 Hz,H-4′),0.84(3H,H-29),0.81(3H,H-27),0.68(3H,s,H-18)。13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δC:140.37(C-5)、121.76(C-6)、99.98(C-1′)、77.36(C-3)、77.04(C-3′)、76.72(C-5′)、73.50(C-2′)、71.83(C-4′)、56.85(C-6′)、56.75(C-14)、56.01(C-17)、51.25(C-9)、45.79(C-24)、40.56(C-13)、39.76(C-12)、37.24(C-4)、36.58(C-20)、36.16(C-1)、35.89(C-10)、33.70(C-22)、31.91(C-7)、31.64(C-8)、28.97(C-2)、28.22(C-25)、27.23(C-16)、25.45(C-15)、24.32(C-18)、23.04(C-18)、21.24(C-11)、19.86(C-26)、19.43(C-19)、18.79(C-21)、18.27(C-27)、12.31(C-18)、12.06(C-29)。以上數據與文獻[37]報道基本一致,故鑒定為對胡蘿卜苷。

2.5 化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由α-葡萄糖苷酶抑制活性測定結果可知(圖4),裂葉蕁麻根乙酸乙酯相分離的6種化合物對對α-葡萄糖苷酶的抑制作用有明顯差別,其中,β-谷甾醇和對甲氧基苯甲醛對α-葡萄糖苷酶幾乎沒有抑制作用,對羥基桂皮酸甲酯、正十六烷酸、反式-對羥基肉桂酸、胡蘿卜苷均有一定的體外活性,其IC50值分別為10.239、10.657、5.234、1.693 mg/mL,由此可知其活性強弱順序為胡蘿卜苷>反式-對羥基肉桂酸>對羥基桂皮酸甲酯>正十六烷酸>對甲氧基苯甲醛>β-谷甾醇,胡蘿卜苷對α-葡萄糖苷酶具有很強的抑制作用,并且強于陽性對照阿卡波糖(IC50=4.254 mg/mL)。

圖4 化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制率

3 討論與結論

本研究以體外α-葡萄糖苷酶抑制率為降糖活性評價方法,對裂葉蕁麻植物的根、莖、葉等不同部位進行考察,結果發現,裂葉蕁麻各部位均具有體外降糖作用,其中根對α-葡萄糖苷酶抑制活性最強,這一結果與前期體內活性研究結果一致[19]。由裂葉蕁麻根不同極性部位活性測定結果可知,除石油醚相外,水相、正丁醇相及乙酸乙酯相均有一定體外降糖活性,其中乙酸乙酯相作用最強,IC50值為8.499 mg/mL,這一結果應該與乙酸乙酯相存在豐富的化學成分有關[38-39]。從裂葉蕁麻根的乙酸乙酯相中鑒定了6個化合物,其中對羥基桂皮肉桂酸甲酯、正十六烷酸、反式-對羥基肉桂酸、胡蘿卜苷對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用,胡蘿卜苷和反式-對羥基肉桂酸抑制作用較強,IC50值分別為1.693、5.234 mg/mL,接近或超過陽性對照阿卡波糖的抑制作用(IC50=4.254 mg/mL),由此推測這些化合物是裂葉蕁麻根發揮體外降糖活性的物質基礎之一,但由于本研究中各化合物的收率較低,并未開展動物體內活性的驗證以及作用機制的探討,這些內容有待于進一步研究。