負載硒蛋白果膠微凝膠的制備、結構表征及體外消化特性研究

董 琦,徐 威,張 碟,蔡 杰,*,程水源, 胡中澤,丁文平,祝振洲,于 添,鄧紹南

(1.武漢輕工大學國家富硒農產品加工技術研發專業中心,湖北省綠色富硒農產品精深加工工程技術研究中心,湖北武漢 430023;2.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023;3.武漢輕工大學生物與制藥工程學院,湖北武漢 430023;4.國家富硒產品質量監督檢驗中心,湖北恩施 445000;5.恩施德源健康科技發展有限公司,湖北恩施 445000;6.湖北楠柏生態農業發展有限公司,湖北恩施 444315)

硒(Se)作為生物體內必需的微量元素,具有重要的生物學作用,其中有機硒相對于無機硒具有更高的吸收、利用率與更強的生物活性[1-2]。植物有機硒主要以硒蛋白、硒酶、硒核糖核酸以及硒多糖等形式存在,且硒蛋白為大分子有機硒的主要形態[3],具有抗氧化作用與增強免疫力[4],對白內障、糖尿病、癌癥及心血管等疾病的防治具有一定功效[5]。肖顏顏等[6]利用不同劑量富硒大麥苗對小鼠進行灌胃,通過小鼠細胞免疫與體液免疫測定試驗,證實了富硒大麥苗能有效提高小鼠細胞免疫與體液免疫的功能。張卓等[7]將脫脂富硒花生干粉中的蛋白質進行分離,并研究了其對DPPH自由基清除能力,結果表明高硒含量蛋白具有更高的還原力和更長的誘導時間。胡玲玲等[8]分別對糙米和富硒發芽糙米中的蛋白進行提取,并分析比對其抗氧化活性,研究結果表明富硒糙米蛋白抗氧化能力(羥自由基(·OH)實驗)與蘆丁和VC相當,但明顯高于普通于糙米蛋白。杜潤峰等[9]進一步以富硒糙米蛋白為原料酶解制備抗氧化肽,并對進行抗氧化性能評估,結果表明其抗氧化能力顯著高于同等條件下非富硒糙米蛋白酶解物。因此,富有機硒食品的研究與開發在我國具有重要的現實意義和廣闊的應用前景。

從高聚硒植物中提取硒蛋白用于特色食品富硒強化是一種有效的加工方法。然而,植物硒蛋白有特殊氣味,使其在富硒食品加工中應用受限。此外,為了減少硒蛋白在胃部的破壞,實現其緩釋、靶向輸送以及高生物利用度,成為了富硒功能食品研究的熱點。國內外學者在此相關領域開展了研究工作。例如,楊飛等[10]利用滴加法制備了負載牛乳血清白蛋白(BSA)的殼聚糖-果膠微膠囊,其能夠有效包埋BSA且顯著延長了釋放時間,明顯改善了緩釋效果。陳莎等[11]采用自組裝技術制備緩釋BSA-橘皮果膠三維網絡結構復合水凝膠,其在模擬胃腸溶液消化實驗中對所包埋的紅景天苷具有一定的緩釋效果。劉佳煒等[12]分別采用明膠和改性明膠對木瓜蛋白酶進行包埋,所制備的明膠-殼聚糖-海藻酸鈉凝膠能有效提高固定化酶的酶活力,其中以改性明膠為原料的效果更明顯。Encina等[13]利用噴霧干燥法制備卵磷脂-魚油微膠囊來改善魚油的氧化穩定性,并研究了噴霧干燥過程中溶劑的使用對微膠囊的影響。本課題組系統研究了復合酶法化優化研制多孔淀粉微膠囊,并用于負載橄欖油制備粉末油脂,在改善液體油使用方便性的同時提高了其存儲穩定[14-15]。以食品材料為壁材,借助其物化性質包埋負載生物活性物質,可以在一定程度上形成“庇護”效應。上述研究為硒蛋白包埋與活性保護提供了借鑒思路,但目前關于硒蛋白微膠囊的研究鮮有報道。

鑒于此,本文以植物硒蛋白生物活性為模型、柑橘果膠為微膠囊壁材,利用凝聚特性構建負載硒蛋白果膠微凝膠,并系統研究了微凝膠的制備工藝,同時采用掃描電子顯微鏡(SEM)、傅里葉紅外光譜儀(FTIR)、熱重分析儀(TGA)以及模擬胃腸液消化試驗進一步對其結構表征及體外消化特性探討,旨在為硒蛋白在富硒食品加工中的穩定性與生物利用研究提供理論依據,為富有機硒食品的開發提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物硒蛋白 由國家富硒農產品加工技術研發專業中心(武漢輕工大學)提供;柑橘果膠(半乳糖醛酸含量65%,酯化度15%) 上海源葉生物科技有限公司;胃蛋白酶、胰酶 Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司;氯化鈣 天津科密歐化學試劑有限公司;鹽酸、氫氧化鈉 國藥集團化學試劑有限公司。

Vario EL Cube元素分析儀 德國元素分析系統公司;FD5-2.5冷凍干燥機 西盟國際集團金西盟(北京)有限公司;SB-5200DTN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;TGL16冷凍離心機 長沙英泰儀器有限公司;S-3000N掃描電子顯微鏡 日立儀器(上海)有限公司;NEXUS670傅里葉紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司;TGA/DSC/1100SF熱失重分析儀 梅特勒-托利多儀器(上海)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 負載硒蛋白果膠微凝膠的制備 微凝膠制備意圖如圖1所示。精確稱取0.05 g硒蛋白與一定濃度果膠溶液混勻,在一定溫度條件下超聲作用20 min后,倒入同樣溫度的一定濃度的CaCl2溶液中混合均勻,期間不斷攪拌以充分反應形成凝膠,抽濾洗滌,除去表面的硒蛋白,將凝膠取出在-20 ℃冰箱中預凍后置于冷凍干燥機中干燥,經研磨過250目篩,得到負載硒蛋白果膠微凝膠。采用上述步驟制備未包埋硒蛋白的果膠微凝膠作為對照樣品。

圖1 負載硒蛋白果膠微凝膠的制備[16]

1.2.2 單因素實驗 經預試驗確定果膠和CaCl2溶液濃度(w/v)、包埋操作溫度為需優化因素,并選取濃度和溫度范圍,具體方法如下:

果膠添加量對包埋率的影響:稱取一定量的果膠以濃度為3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%的比例溶于10 mL去離子水,加入0.05 g硒蛋白,置于20 ℃超聲波清洗機中作用20 min,倒入10 mL相同溫度的質量分數為3.0%的CaCl2溶液,重復1.2.1中步驟,得負載硒蛋白果膠微凝膠,用元素分析法測定氮元素含量,計算包埋率及載硒量。

包埋操作溫度對包埋率的影響:稱取0.05 g硒蛋白,與濃度4.5%的果膠分別在10、20、30、40、50 ℃超聲波清洗機中作用20 min,之后倒入相同溫度的濃度為3.0%的CaCl2溶液,重復1.2.1中步驟,得負載硒蛋白果膠微凝膠,用元素分析法測定氮元素含量,計算包埋率及載硒量。

CaCl2添加量對包埋率的影響:稱取一定量的CaCl2以濃度為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的比例溶于10 mL去離子水。配制濃度為4.5%的果膠溶液,添加0.05 g硒蛋白,置于20 ℃超聲波清洗機中作用20 min,加入不同濃度的CaCl2溶液。重復1.2.1中步驟,得負載硒蛋白果膠微凝膠,采用元素分析法測定氮元素含量,計算包埋率及載硒量。

1.2.3 微凝膠制備工藝的正交試驗 綜合單因素實驗結果,確定因素水平優化范圍,選用L9(34)正交表,對果膠包埋硒蛋白結果進行驗證。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.4 包埋率和載硒量的計算 采用元素分析法測定:準確稱取負載硒蛋白果膠微凝膠質量m1,每份樣品添加硒蛋白(蛋白質含量40%)質量m2；分別取(5±0.25) mg負載硒蛋白果膠微凝膠和硒蛋白原料,基于元素分析測定樣品中氮元素百分比N1,計算包埋率T。利用原子熒光光譜法測定硒蛋白中硒含量C1[17],進而計算樣品中載硒量:

1.2.5 微膠囊結構表征

1.2.5.1 微觀形貌分析 將硒蛋白、負載硒蛋白果膠微凝膠和空白果膠微凝膠,用導電膠固定到樣品臺上,經真空鍍金后,使用掃描電子顯微鏡(SEM)對樣品進行表面微觀結構觀察。

1.2.5.2 紅外光譜分析 采用傅里葉紅外光譜儀(FTIR)通過KBr壓片法測定硒蛋白、負載硒蛋白果膠微凝膠和空白果膠微凝膠的分子結構,范圍4000～400 cm-1,分辨率4 cm-1,掃描16次。

1.2.5.3 熱穩定分析 稱取5 mg硒蛋白、負載硒蛋白果膠微凝膠和空白果膠微凝膠,采用熱重分析儀(TGA)在N2氣氛中(流速為20 mL/min),以10 ℃/min的加熱速率從30 ℃升溫至800 ℃觀察其熱失重質量變化。

1.2.6 胃腸道緩釋性能研究 制備人工胃液、腸液,模擬消化累計釋放試驗[18-19]:采用最佳工藝制備的包埋硒蛋白的微凝膠和空白微凝膠,各分為9份,每份稱取0.2 g樣品,置于錐形瓶中,在錐形瓶中加入10 mL的模擬胃液(pH2.0),于(37±0.50) ℃恒溫搖床中振蕩,振蕩速度為 100 r/min,定時取出一份樣品,勻漿機10000 r/min破碎攪勻,4000 r/min離心10 min,取上清液用Bradford蛋白濃度試劑盒測定樣液中的硒蛋白含量,模擬胃液消化2 h后,取出剩余的樣品,在樣品中加入10 mL的模擬腸液,繼續消化,定時取出樣品,測定樣品中的硒蛋白含量n,以相對釋放率對時間繪制出釋放曲線。

1.3 數據處理

每組實驗重復3次。采用SPSS 19.0處理數據,顯著性水平為P<0.05,作圖采用Origin 9.0版本。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 果膠濃度對包埋率的影響 如圖2所示,果膠濃度在3.5%～4.0%時,包埋率略有上升,而由4.0%增加至5.0%時,包埋率迅速上升,當果膠濃度超過5.0%時,包埋率基本不變。這是由于在Ca2+濃度不變的前提下,果膠分子的增加,會提高網絡締合區數目,使凝膠更加緊密,從而提高包埋率。在果膠濃度5.0%～5.5%,分子間氫鍵會不斷加強,但同時疏水相互作用同比增加[20],粘度增大,包埋硒蛋白不夠均勻,使得包埋率沒有提高。

圖2 果膠濃度對包埋率的影響

以每克樣品中載硒量為指標時,由于制備每份樣品添加的硒蛋白質量一定,當果膠濃度為3.5%時,每份樣品的質量較小,1 g樣品所取用樣品份數較多,相應硒蛋白添加量會更多,故而載硒量計算值較高。當果膠濃度達到5.5%時,每份樣品質量較大,1 g樣品中硒蛋白添加量會較少,于是出現載硒量先下降后上升,再下降的趨勢。因此選擇5.0%作為制備負載硒蛋白果膠微凝膠的最佳果膠濃度。

2.1.2 包埋操作溫度對包埋率的影響 由圖3可知,從10～50 ℃之間負載硒蛋白果膠微凝膠包埋率逐步增大,這是因為隨著溫度的升高,能夠提高果膠與Ca2+的聚合反應,加快凝膠速率,30～50 ℃增加程度小于10～30 ℃,并且趨于平緩,可能是因為包埋是一個放熱過程,當溫度升高后微凝膠的形成受阻[21]。考察載硒量,與包埋率的增長趨勢基本一致。因此選擇30 ℃為最適包埋溫度。

圖3 包埋操作溫度對包埋率的影響

2.1.3 CaCl2濃度對包埋率的影響 由圖4可知,負載硒蛋白果膠微凝膠包埋率在1.0%～2.0%呈增大趨勢,這是因為低酯果膠分子鏈間的羧基與Ca2+形成離子鍵形成更有網絡空間結[22-23],當Ca2+濃度增大時,能夠有效的形成凝膠,將硒蛋白包裹,提升包埋率。在2.0%～5.0%逐漸降低,可能是因為Ca2+濃度繼續增大時,三維結構開始收縮[20],凝膠強度逐漸變弱,在洗滌干燥過程中造成硒蛋白的流失;當CaCl2濃度在2.0%時,包埋率達到最大值。載硒量趨勢和包埋率相同,故而在實驗中選擇2.0%的CaCl2濃度作為最優濃度。

圖4 CaCl2濃度對包埋率的影響

2.2 微凝膠制備的正交試驗

正交試驗結果見表3，方差分析見表4,可知，因素A顯著、因素B、C不顯著,負載硒蛋白果膠凝膠工藝的因素影響順序為:A>C>B,即果膠濃度>CaCl2濃度>包埋操作溫度。得到最佳實驗因素水平為A2B2C2,但該組合不在此正交實驗中。根據此條件重新實驗,制備樣品,測得其包埋率為66.3%±1.64%,載硒量為(308±8.71) μg/g,高于正交試驗中的最優組合,進而確定包埋的最佳工藝為果膠濃度為5.0%,包埋操作溫度為30 ℃,CaCl2濃度2.0%。經過果膠微凝膠包埋后,硒蛋白的特殊氣味得到了有效掩蓋。

表3 果膠包埋硒蛋白的正交試驗結果

表4 方差分析

2.3 微凝膠結構表征

2.3.1 微觀形貌分析 利用SEM對樣品的微觀形貌進行表征。從圖5a、圖5b可以看出硒蛋白呈均勻球形,果膠凝膠研磨之后為光滑片狀。利用果膠形成微凝膠對硒蛋白進行包埋之后,由圖5c明顯可以看到果膠微凝膠表面明顯凹凸不平,但未出現破裂現象,有圓球狀物質被緊密包裹,證實了硒蛋白成功被包埋,形成了負載硒蛋白果膠微凝膠。

圖5 掃描電子顯微鏡圖

2.3.2 紅外光譜分析 在硒蛋白質包埋入果膠微凝膠的基礎上,進一步借助FTIR分析分子官能團的差異。圖6展示了硒蛋白、空白果膠微凝膠和負載硒蛋白果膠微凝膠的紅外譜圖。對比硒蛋白和負載硒蛋白果膠微凝膠的紅外譜圖,880 cm-1附近有吸收峰,可能是Se與蛋白形成共價鍵;1240 cm-1處的吸收峰為酰胺III帶,為蛋白質特征峰,是C-N的伸縮振動和N-H的彎曲[24],而空白果膠微凝膠無該峰。對比空白果膠微凝膠和負載硒蛋白果膠微凝膠的紅外譜圖發現,在1030和1100 cm-1有吸收峰,為糖苷鍵和呋喃環的骨架C-O和C-C振動帶,這是多糖在指紋區的特征吸收峰[25]。負載硒蛋白果膠微凝膠同時顯現出芯材和壁材的特征峰,說明硒蛋白和果膠微凝膠發生了作用,制成的果膠微凝膠成功負載了硒蛋白。這與SEM研究結論相一致。

圖6 負載硒蛋白果膠微凝膠紅外光譜圖

2.3.3 TGA分析 通過在N2氛圍下進行熱失重分析,考察硒蛋白和微凝膠的熱分解行為。如圖7所示,TGA曲線直觀顯示了硒蛋白、果膠微凝膠和負載硒蛋白果膠微凝膠的熱性能變化。從圖中可以看出,當溫度從30 ℃升至100 ℃時,硒蛋白質量下降8.2%,這是由于樣品中水分的減少。而果膠微凝膠和負載硒蛋白果膠微凝膠分別下降15.6%、14.8%,這可能是因為果膠微凝膠在凍干后具有強吸水性。隨著溫度的升高,在100～132 ℃之間硒蛋白的加熱失重線進入一個平臺區,之后分解速率開始急劇上升,這是因為硒蛋白開始熱分解,而果膠微凝膠和負載硒蛋白果膠微凝膠熱分解相對緩慢。當溫度繼續上升至552 ℃,硒蛋白質量損失達71.4%,而果膠微凝膠和負載硒蛋白果膠微凝膠失量損為58.8%、60.8%,由此可以說明硒蛋白果膠微凝膠被成功包埋,且果膠微凝膠致密保護膜的包裹有利于硒蛋白熱穩定性。

圖7 負載硒蛋白果膠微凝膠熱重分析曲線圖

2.4 胃腸緩釋性能研究

由圖8可知,果膠凝膠包埋硒蛋白的樣品在模擬胃液中消化2 h,累計釋放了6.1%的硒蛋白,這一過程較為緩慢,這是由于果膠與Ca2+形成的聚合物在模擬胃酸的酸性(pH=2.0)條件下較為穩定,微凝膠表面不易破裂,有效的保護了包裹在內部的硒蛋白;進入模擬腸液后,硒蛋白迅速釋放,在腸液消化9 h后,釋放已經接近飽和,此時的釋放量高達73.6%,這是由于果膠與Ca2+形成的微凝膠在模擬腸液(pH=6.8)中發生膨脹,表面破裂,無法有效保護內部包埋的硒蛋白。釋放實驗結果表明,果膠凝膠包埋后的硒蛋白在進入生物體后,在模擬胃液中的狀態較為穩定,進入腸液后,釋放速度和釋放量遠遠大于在模擬胃液中,說明采用果膠為壁材包埋硒蛋白制備的微凝膠確實具有腸溶性,使得硒蛋白減少了在胃中胃液的破環。以上研究技術有望實現硒蛋白緩釋、靶向輸送以及提供高生物利用度,可用于開發富硒食品。

圖8 負載硒蛋白果膠微凝膠在模擬胃腸液中連續釋放曲線

3 結論

為了改善植物硒蛋白有特殊氣味,同時減少硒蛋白在胃部功能成分的破壞,實現其緩釋、靶向輸送以研制富硒功能食品。本研究以柑橘果膠為微膠囊壁材,利用凝聚特性構建負載硒蛋白果膠微凝膠。具體研究結論如下:在單因素的基礎上結合正交試驗得到負載硒蛋白果膠微凝膠最佳工藝條件:果膠濃度5.0%(w/v)、CaCl2濃度為2.0%(w/v)、包埋操作溫度30 ℃。在此條件下硒蛋白包埋率為66.3%±1.64%,并經原子熒光光譜法測定載硒量為(308±8.71) μg/g。經過果膠微凝膠包埋后,硒蛋白的特殊氣味得到了有效掩蓋;通過SEM結果可以直觀觀察到硒蛋白被完整有效的包裹在果膠微凝膠中,而FTIR和TGA測試分別從分子結構和熱失重曲線變化上驗證了這一結果。此外,TGA分析還證實了硒蛋白被果膠微凝膠包埋后其熱穩定性得到了明顯的提高;模擬體外消化實驗表明:在胃液2 h體系中硒蛋白的累計釋放量僅為6.1%,而模擬腸液消化9 h后累計釋放達73.6%,說明在微凝膠化后可以增強硒蛋白的環境穩定性,有效減少其在胃液中的破壞,提高其在腸液中的緩釋能力。

以上研究結論,為硒蛋白在富硒食品加工中的穩定性與生物利用研究提供了理論基礎,同時提出了一種研制富有機硒食品的新途徑。在后續工作中,將進一步對負載硒蛋白果膠微凝膠的體內生物利用度及功能性評價開展研究,推進其作為有效的有機硒源應用于富有機硒食品的開發。