稻谷儲藏過程霉菌揮發性物質和品質分析

夏雨杰,汪 靜,陳尚兵,邢常瑞,袁 建

(1.南京財經大學食品科學與工程學院,江蘇南京 210023;2.南京中儲糧糧油質檢中心,江蘇南6京 211151)

我國是世界上稻谷消費和生產大國,稻谷食用消費約占稻谷消費的80%,全國超過一半的人以大米為主食[1]。水稻收獲后除去直接使用,絕大多數以稻谷形式儲藏,然而稻谷是有機的生命體,在儲藏期間因為水分、濕度等因素的影響,加上稻谷中存在大量微生物,導致曲霉菌與青霉菌的滋生,稻谷發熱產生霉變,直接降低儲藏稻谷的品質,稻谷儲藏的品質與安全防控問題一直是稻谷儲藏研究熱點[2-4]。

霉菌污染稻谷后,一方面引起稻谷變質,導致這類稻谷的發芽能力極低,降低稻米市場流通性;另一方面易引發人體肝臟的病變,產生神經毒性及免疫毒性,同時致癌、致畸、誘發突變,嚴重危害人體健康[5-7]。目前對霉菌侵染稻谷研究主要集中于研究霉菌活動特性、生長趨勢及霉菌毒素方面。黃淑霞等[8]研究霉菌活動特性發現:霉菌活性與糧食的吸濕性及糧粒外皮有關,霉染糧食的黏度、脂肪酸值、發芽率存在差異。唐小俊等[9]將稻谷高溫貯藏,控制95%濕度條件下霉菌數量增加速度最快,總數量隨著濕度的上升而增加;將稻谷在高濕貯藏,控制40 ℃條件下增加速度最快,總數量隨著溫度的升高而增加,霉菌的生長趨勢速度隨溫度濕度的增加而加快,溫度濕度越大,稻谷更易霉變。污染霉菌的谷物會產生有毒的次級代謝產物,霉菌毒素溶解性差、分解緩慢、穩定性高,霉菌毒素幾乎攻擊人體所有器官,破壞機體DNA與RNA結合并抑制蛋白質合成,目前用氨化降解霉菌毒素(水分含量>18%,1%氨水,40～50 ℃時氨化48 h,經6～7 d晾曬之后檢測)雖然總體破壞率達到98%,但谷物喪失食用性,使用吸附劑吸附霉菌毒素,但吸附劑化學鍵之間存在不具選擇性及易受機體環境影響[10-11]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淮稻5號 江蘇淮安涇口鎮橋頭8組;平板計數瓊脂培養基PCA、孟加拉紅培養基、高鹽察氏瓊脂培養基、直鏈淀粉標準溶液、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉 國藥集團化學試劑有限公司;氯化鈉、次氯酸鈉 北京精細化學品有限責任公司;α-淀粉酶活性檢測試劑盒、脂肪酶(LPS)活性檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;過氧化物酶測試盒 南京建成生物工程研究所;黑曲霉、白曲霉、黃曲霉、產黃青霉 北京微生物菌種中心。

XOGZ-8 KW型連續隧道式微波干燥滅菌線 南京先歐儀器制造有限公司;BLH-3250型試驗用礱谷機、JNMJ6型檢驗碾米機 浙江臺州市糧儀廠;101-34S型電熱鼓風干燥箱 上海蘇進儀器設備廠;SX-700型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;GNP-9160型隔水式恒溫培養箱、GHP-250型智能光照培養箱 上海三發科學儀器有限公司;VOSHIN-600R型無菌均質器 無錫沃信儀器有限公司;PQX-300D多段可編程人工氣候箱 寧波東南儀器有限公司;TM-3000掃描電子顯微鏡 日本株式會社日立制作所;GC(7890A)-MS(5975C)氣質聯用分析儀 美國安捷倫公司;50 μm-PDMS/DVB/CAR固相微萃取頭 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子懸浮液制備 將黑曲霉、白曲霉、黃曲霉、產黃青霉4種霉菌接種于察氏培養皿上,(28±1) ℃培養5 d,無菌水洗脫孢子于錐形瓶中,用無菌紗布過濾除去菌絲體,4000 r/min離心15 min,血球計數板計數,0.85%生理鹽水將濃度調至105～106CFU/mL搖勻。

取樣:稻谷60 g分為5等份,4份樣品接種4種不同的菌懸液,1份作為空白對照組,4組平行。樣品均儲藏(28 ℃、80% RH),每隔7 d測定樣品菌落總數。

1.2.2 霉菌孢子懸浮液孢子數測定 參照LS/T 6132-2018 《儲糧真菌的檢測》 孢子計數法進行測定。

1.2.3 霉菌菌落總數測定 參照GB 4789.15-2016《食品微生物學檢驗》 霉菌和酵母計數進行測定。

1.2.4 稻米品質測定

四是地區之間低保標準差距較大。由于低保屬于社會救助范疇，基本按照行政隸屬關系承擔本級社會救助支出責任，只有大的自然災害才由中央財政安排專項災害救助資金。因此，經濟發達的省份財政支持能力較強，城鄉低保資金投入就多，人均低保標準就高；而經濟較落后的西部地區，地方財政依靠中央財政轉移支付維持運轉，投入到城鄉低保的資金就少，低保標準明顯偏低。從農村低保標準看，2017年12月排在前3位的地區分別是上海市人均每月970元，北京市900元，天津市860元；排在后3位的地區分別是青海省人均每月277.9元，廣西壯族自治區278.2元，云南省278.5元。最高的上海市是最低的青海省的3.49倍。

1.2.4.1 稻谷標準測定 稻谷出糙率測定參考GB/T 5495-2008方法;稻谷整精米率測定參考GB/T 21719-2008方法;稻谷不完善粒測定參考GB/T 5494-2008方法;大米堊白粒率測定參考GB/T 17891-2017方法;稻谷水分測定參考GB 5009.3-2016方法;稻谷直連淀粉含量測定參考GB 15683-2008方法;稻谷糊化特性測定參考GB/T 24852-2010方法。

1.2.4.2 稻谷α-淀粉酶活力測定 采用試劑盒測定其酶活,淀粉經水解酶催化水解產生還原糖,還原3,5-二硝基水楊酸產生棕紅色物質,測定在540 nm處吸光度增加速率,計算得出淀粉酶活性大小。酶活力按照每g稻谷每隔一分鐘催化后產生1 mg還原糖作為1個酶活力單位。

1.2.4.3 過氧化物酶活力測定 采用試劑盒測定其酶活,過氧化物酶催化過氧化氫反應,測定波長在420 nm處吸光度的變化規律,判斷其酶活性大小。酶活性大小依據每g稻谷每一分鐘催化底物量為1 μg的酶量作為一個酶活力單位。

1.2.4.4 脂肪酶活力測定 采用試劑盒測定其酶活,脂肪酶催化油酯水解成脂肪酸,采用銅皂法測定脂肪酸生成效率,在波長420 nm處測定吸光度變化情況。其活力大小依據每g稻谷每分鐘水解油脂生成1 μmol脂肪酸作為一個酶活單位。

1.2.5 大米微觀結構的測定-掃描電子顯微鏡測試 樣品顆粒粘在掃描電鏡樣品盤,放入離子濺射儀的噴金室(濺射電流為1.5 A,加速電壓為15 kV,濺射時間90 s)。掃描電鏡下觀察稻谷及糙米表面菌落狀態。

1.2.6 GC-MS采集 從樣品接種霉菌開始,選擇時間節點0、7、14、21、28 d,從中取出20.00 g在GC-MS儀器上檢測分析,置于100 mL固相微萃取樣品瓶,氣相色譜進樣口(250 ℃),解吸5 min。起始溫度50 ℃,保持5 min,然后以8 ℃/min的升溫速度升溫到125 ℃,再以4 ℃/min的升溫速度升溫到165 ℃,最后以10 ℃/min 的速度升溫到230 ℃,保留2 min。

GC-MS相關儀器參數條件:色譜柱型號:HP-5MS毛細管柱(30m×0.25mm,0.24 μm);載氣:氦氣;載氣流速:24.00 mL/min;采用不分流進樣模式;AUX-2溫度:280 ℃;離子源:EI;離子源溫度:230 ℃;電子能量:70 eV;采集模式:全掃描[13]。

1.3 數據處理

圖表由Origin Pro 2016繪制,數據由SPSS 22.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 染菌稻谷菌落總數

侵染優勢菌的稻谷與未接種的稻谷樣品表面霉菌生長情況如圖1所示。由圖1可知,受霉菌侵染稻谷的霉菌生長較快,且霉菌生長較快的稻谷在后期發生較嚴重霉變現象,其中黑曲霉、黃曲霉、產黃青霉生長速度較快。田國軍等[14]在研究不同儲藏條件下稻谷霉菌總數變化規律時發現,稻谷處于合適的溫濕度條件下,糧食不易發生霉變。同時相關研究發現，糧食儲藏過程中，隨著時間的延長，阿姆斯特丹曲霉會取代黃曲霉成為優勢霉菌,但黑曲霉一般含量不變[15]。在稻谷儲藏過程當中微生物會引起一系列的代謝變化,產生特殊性氣味,優勢菌也會隨著發生變化。

圖1 稻谷樣品菌落總數變化

2.2 染菌稻谷感官品質分析

染菌稻谷的質量檢測指標如表1所示。不同霉菌侵染28 d后,稻谷品質與第0 d和未接種樣品相比較,在出糙率、整精米率方面均有下降,染菌稻谷整體的不完善粒率在上升。在稻谷儲藏期間,稻谷表面優勢菌的生長導致稻谷質量下降。參照GB 1350-2009對三級精米的要求:整精米率≥55%,不完善粒率≤5%。染菌稻谷因為在儲藏期間,霉菌存在活性,會破快稻谷表觀品質因此物檢不完善粒時,發現霉變粒、病斑粒、蟲蝕粒的數量上升,出糙率、整精米率、不完善粒率檢測結果均低于國家優質精米要求;染菌的稻谷整精米率明顯下降,是由于在儲藏過程中染霉稻谷自身的呼吸作用加快使干物質消耗量增多,從而引起稻谷組織疏松,整精米率下降[16-17]。

表1 稻谷感官品質檢測結果

2.3 染菌稻谷理化品質分析

稻谷酶活力代表著稻谷新陳代謝的能力,酶活力數值高則表明谷物的活性強、新鮮度高、稻谷的品質較好[18]。稻谷是以淀粉為主的淀粉類糧食,存在α-淀粉酶,α-淀粉酶會酶解淀粉,在實際的儲藏過程中,α-淀粉酶活性是隨著儲藏時間的延長而變化的,對稻谷的食用品質產生一定的影響[19]。未接種與初始值稻谷比較發現,α-淀粉酶的活力降低了0.07 mg/(min·g),并存在顯著差異(P<0.05)。比較染菌稻谷和未接種稻谷α-淀粉酶活力值,發現染菌稻谷的酶活力遠低于未接種稻谷的酶活力,稻谷染霉后α-淀粉酶活性逐漸降低,稻谷淀粉顆粒形態組成發生變化,樣品的直鏈淀粉含量升高,表明稻谷品質下降,容易導致米飯蒸煮過程中水分難以滲透,制得的米飯口感較硬。因為在一定范圍內,直鏈淀粉含量越低,稻米品質越好[20]。

過氧化物酶存在于糧食籽粒中,與糧食口感密切相關。大米隨著儲藏時間延長,過氧化物酶活性會減弱[21]。由表2可知,隨著儲藏時間的延長,染菌組、未接種稻谷的過氧化物酶值與儲藏第0 d的稻谷相比均下降,并與初始值存在顯著性差異(P<0.05)。

表2 稻谷品質指標測試結果

脂肪酸含量是評價稻谷是否宜存的重要指標,一般來說脂肪酸值越高,糧食品質越差,越不易于儲藏[22]。侵染優勢霉菌組稻谷的脂肪酸值與未接種稻谷脂肪酸值相比顯著升高(P<0.05),同時依據國家標準GB/T 20569-2006受霉菌侵染嚴重的大部分稻谷已不適宜繼續儲存,甚至一些已經不能食用。根據上述結果可以得出在稻谷儲藏過程中,過氧化物酶與脂肪酸值呈現負相關,稻谷受到霉菌侵染后α-淀粉酶活力也開始下降,因此整體表現為稻谷氣味酸敗和口味變差。

2.4 染菌稻谷糊化特性分析

RVA譜特征值反映淀粉粘滯特性與米飯的食味品質存在關聯[23]。隨著儲藏時間的延長,染菌稻谷淀粉粒表面的親水作用減弱,水分滲透細胞的能力和速度下降,大米溶脹程度受到抑制,峰值黏度和崩解值下降,同時加上微生物的代謝作用,淀粉結構易被破壞,表明大米出現明顯陳化[24]。

消減值與米飯冷卻后的質地相關聯,一般消減值為負值,米飯往往過黏;消減值為正值且過大時,米飯硬而糙,消減值小則軟而不黏結[25]。從表3可以看出,受霉菌侵染的稻谷的消減值處于181.5～248.7 cp的范圍,未接種霉菌稻谷的消減值約為-436.0 cp。

表3 稻谷淀粉糊化過程中的特征值

回生值的大小與直鏈淀粉的聚合度及支鏈淀粉的微觀結構有關,直鏈淀粉聚合度高,易于被老化的是外鏈長的支鏈淀粉[26]。未接種霉菌與染菌霉變稻谷之間回生值不存在顯著性的差異。同時糊化溫度也是揭示淀粉品質的指標之一,當淀粉糊化溫度比臨界溫度高時晶體發生崩解,黏度值突然升高,溶脹現象開始出現,并且越來越接近峰值黏度。染菌組稻谷的糊化溫度處于72.8～74.6 ℃的范圍,未接種霉菌稻谷的糊化溫度約為70.1 ℃,染菌組稻谷樣品的糊化溫度要略高于未接種霉菌的稻谷,同時也存在顯著性差異(P<0.05)。

2.5 掃描電子顯微鏡分析

本研究采用掃描電子顯微鏡觀察染菌稻谷儲藏28 d霉變后去殼后稻谷表面菌的生長狀態,不同放大倍數的掃描電子顯微鏡結果如圖2和圖3所示。初始組和未接種菌的糙米表面較為光滑,表面無明顯聚集,并且稻米顆粒表面較光滑。染菌稻谷去殼后觀測到有菌絲體依舊附著在大米表面,說明稻谷的米糠層已被破壞,盡管稻谷儲藏期間不同霉菌對稻谷侵染能力不同,但四種霉菌均開始侵染了籽粒內部,結合上述感官、質量品質及糊化品質結果可以推斷出，稻谷內部亞糊粉層以及胚部淀粉顆粒均發生一定程度的變化,食用品質開始下降,因此對儲糧霉菌安全不容忽視[27-28]。

圖2 掃描電子顯微鏡圖譜(200×)

圖3 掃描電子顯微鏡圖譜(1000×)

2.6 GC-MS結果分析

根據表4可以看出,在侵染稻谷儲藏前期,四種染霉稻谷所測數據并沒有太大差異,但隨著時間的延長,其氣味組成存在差異,分析在儲藏期間,微生物的生物活性在不斷發生變化,引起揮發性氣味產生差別。酮基、醛基羥基等含氧基團和含氮基團是稻谷的揮發性氣味的來源,此類物質在稻谷儲藏期間的產生差異較大[29-30]。受白曲霉侵染稻谷在儲藏期間,苯環類物質相對含量范圍在6.74%～15.94%,主要表現是隨著時間的變化含量在增加,在后期苯酚類、含氧基團苯環類出現,醛類物質整體上呈現下降趨勢,且含量較低,不過與稻谷氣味密切相關;受到產黃青霉侵染稻谷,酮類、酯酸類物質含量范圍分別在1.86%～8.11%和6.83%～13.56%,都是在第21 d含量較大,說明在儲藏后期稻谷已經發生霉變,產生味道方面的差異;受黑曲霉侵染稻谷,醇醚類物質含量在5.39%～11.94%,在儲藏后期含量增加較多,醛類物質含量在2.13%～5.12%之間,前期變化較為緩慢,第21 d后發生較大的變化;受黃曲霉侵染稻谷,苯環類物質含量在8.9～16.52%,酯酸類物質含量在8.79%～12.61%,這兩類物質相對含量在7 d后有增長的趨勢,醛類物質含量變化較為明顯,主要原因是黃曲霉侵染稻谷加快脂類酶促氧化產生過氧化物及羰基化合物,脂質水解產生劣變氣味物質即醛類物質[31]。隨著天數的變化受到霉菌感染程度會不同,所產生的揮發性氣味有一定的區別。烴類物質在染霉儲藏階段一直占據主要位置,苯環類物質和醇醚類含量在不斷上升,醛、酮類物質含量占據比例較少。霉菌侵染的稻谷表面的生長狀態及菌落數差異性,進一步證實了稻谷在儲藏階段產生的揮發性物質成分含量的變化。

表4 稻谷的主要揮發性物質分類及相對含量變化

3 結論

本研究選擇將黑曲霉、白曲霉、黃曲霉、產黃青霉四種常見優勢霉菌接種經微波滅菌后的稻谷上,并對其儲藏品質進行研究。研究發現霉菌侵染稻谷中受到白曲霉、黃曲霉、黑曲霉的霉菌生長速度較快。染菌稻谷出糙率和整精米率明顯降低,不完善粒率明顯提高,染菌稻谷的出糙率<77%,整精米率<55%,稻谷品質低于國家三級精米的要求,已然不符合正常的稻谷儲藏標準。

染菌稻谷的峰值黏度在3241.5～3698.6 cp之間,低于未接種霉菌的稻谷4781.2 cp,反映染霉稻谷α-淀粉酶活下降,同時糊化溫度上升。因此可以推測染霉稻谷淀粉結構因霉菌生物活性發生了變化,淀粉顆粒蓬松易破裂,同時大米直鏈淀粉含量增加且淀粉的結晶度也會升高,因此染霉稻谷蒸煮出來的米飯,氣味酸敗,硬度較大,品質整體低于未接種霉菌的稻谷。用掃描電子顯微鏡可以觀察到染霉稻谷去殼后表面依舊存在菌絲聚集,稻谷雖有谷殼保護,但霉菌菌絲已通過谷殼縫隙開始侵染稻谷內部并稻谷微觀結構。GC-MS對儲藏期間染菌稻谷的揮發性氣味成分分析顯示不同霉菌侵染的稻谷儲藏期間揮發性成分的變化有差異,侵染稻谷儲藏前期揮發性成分差異不大,但隨儲藏時間延長烴類、苯環、醇類、醛類、酮類、酯酸組成發生改變,根據染菌稻谷菌落總數變化,可以推測因為微生物生物活性發生變化,引發揮發性氣味改變。