湖南剁辣椒中優良乳酸菌的篩選鑒定及其發酵辣椒汁風味研究

許 彎,劉 偉,胡小琴,胡梓妍,楊 麗,張菊華,*

(1.湖南大學研究生院隆平分院,湖南長沙 410125;2.湖南省農業科學院農產品加工研究所,湖南長沙 410125;3.辣妹子食品股份有限公司,湖南益陽 413100)

辣椒營養物質豐富,可提供必需的維生素和礦物質[1],具有預防心血管疾病、改善消化功能、減肥和促進血液循環等功效[2]。辣椒剁碎后經過自然發酵加工制成的剁辣椒,口感鮮辣脆爽,既可增強食欲又可促進消化,備受消費者喜愛[3]。剁辣椒營養價值很高,富含蛋白質和維生素,是湖南的特色食品之一,可出壇即食,也可當作佐料做菜。研究發現,剁辣椒在自然發酵中起主導作用的微生物是乳酸菌,乳酸發酵不僅可抑制腐敗菌的生長,而且產生獨特的風味物質[4]。乳酸菌是公認的健康級微生物,研究表明乳酸菌可調節腸道內菌群平衡[5]、增強人體抵抗力[6]、抗氧化作用[7]、抗衰老[8]、降低膽固醇[9]等生理功能。

自然發酵存在周期長,易產生雜醇,發酵結果不可控等問題,嚴重影響了剁辣椒生產的規模化、標準化。開展優良性能的乳酸菌發酵劑篩選和接種純菌種發酵可優化發酵工藝、縮短發酵時間、保證質量。目前從辣椒中分離純化乳酸菌的研究較多,夏海燕等[10]從酢辣椒篩選出短乳桿菌L3-5和發酵乳桿菌17-1具有較高的抗氧化能力,沙漠等[11]從辣椒醬篩選出產酸量高的植物乳桿菌和腸膜明串珠菌,葉陵等[12]從剁辣椒篩選的植物乳桿菌比短乳桿菌耐脅迫能力強,但篩選的菌株仍存在發酵環境適用性差和發酵后品質殘次不齊的問題。

本研究從自制的剁辣椒中分離純化乳酸菌,16S rDNA鑒定菌株種屬,進行耐酸耐鹽試驗,對人工接種辣椒汁發酵過程中pH、乳酸菌數的動態變化進行了研究,通過GC-MS對發酵的辣椒汁揮發性物質分析,篩選出產酸及產香能力優良的乳酸菌,旨在為乳酸菌后續工業化的應用及研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黃貢椒 湖南省衡東縣;七星椒 湖南省桃源縣;三味椒 湖南省新田縣;大沖辣椒 湖南省臨武縣;博辣紅牛、博辣艷麗、小米椒、湘研28號、長辣7號、二荊條 湖南省長沙縣;朝天椒、燈籠椒 長沙市芙蓉區隆禹蔬菜市場;MRS固體培養基、MRS液體培養基、酵母浸膏 廣東環凱微生物科技有限公司;碳酸鈣 天津市科密歐化學試劑有限公司;氫氧化鈉、葡萄糖、磷酸氫二鉀 國藥集團化學試劑公司。

HWS型恒溫恒濕培養箱 寧波江南儀器廠制造;SW-CJ-1C型超凈工作臺 蘇州市金凈凈化設備科技有限公司;UV-1800型紫外可見分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司;MC-D500U(E)/PH-HK顯微鏡 鳳凰光學股份有限公司;LDZM-80L-III型滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;7890A-5975C型氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 自然發酵剁辣椒制備 以黃貢椒、三味椒、大沖辣椒、博辣紅牛、博辣艷麗、小米椒、湘研28號、長辣7號、二荊條、朝天椒等辣椒為原料,清洗晾干,各稱取2 kg剁碎,添加8%的食鹽,混勻,裝壇進行發酵[13]。

1.2.2 菌株分離純化 分別稱取10 g自然發酵剁辣椒于含有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中,經梯度稀釋后,選取10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋度吸取每0.1 mL涂布于含有碳酸鈣的MRS固體培養基上,在37 ℃培養箱中培養2～3 d。用接種環選取有鈣溶圈的單個菌落進行平板劃線分離,純化2～3次。對疑似乳酸菌的菌株進行過氧化氫接觸酶試驗、革蘭氏染色及鏡檢,挑取革蘭氏陽性、無芽孢、接觸酶陰性的菌株進行斜面保存和甘油管冷凍保存(菌液和50%甘油按1∶1比例保存)[14]。

1.2.3 初篩 將純化后的單菌落接種于5 mL的MRS液體培養基中,37 ℃培養24 h,用紫外可見分光光度計在600 nm處測OD值,利用pH計檢測各菌株發酵液pH[12],選取OD值較高且pH較低的菌株進行后續實驗。

1.2.4 復篩 將初篩的乳酸菌于MRS固體培養基37 ℃培養2～3 d,挑取單菌落于MRS液體培養基中培養24 h,吸取1 mL發酵液于錐形瓶中,加50 mL無菌蒸餾水稀釋,采用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定測得酸度,每組滴定做3次平行,選取較高酸度的菌株進行后續實驗。

1.2.5 形態學鑒定 將斜面保存的乳酸菌在平板上涂布,37 ℃培養2～3 d,觀察菌落形態,制成菌懸液,在1000倍顯微鏡下觀察菌株形態。

1.2.6 分子生物學鑒定 對篩選的乳酸菌提取總DNA,進行PCR擴增,引物27F:5′-AGTTTGATC MTGGCTCAG-3′,1492R:5′GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′,PCR反應體系:Mix25 μL,模板DNA1 μL,27F 2 μL,1492R 2 μL,ddH2O 20 μL;PCR擴增條件:94 ℃ 2 min;94 ℃ 45 s、55 ℃50 s、72 ℃ 2 min,30個循環;72 ℃ 10 min;4 ℃ 延伸60 min。產物經濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化,送至生工生物工程(上海)公司測序。將測序結果在NCBI中的BLAST程序中比對,用MEGA 4.0軟件構建同源序列系統發育樹。

1.2.7 乳酸菌生長特性研究

1.2.7.1 生長曲線的測定 將乳酸菌按2%的接種量于MRS液體培養基中,未接種的培養基為空白對照,37 ℃培養(100 r/min),發酵前期每隔2 h測定菌液的OD600值,后期間隔10 或12 h測定菌液的OD600值。活菌數采用平板計數法[15]。

1.2.7.2 耐酸耐鹽能力測定 將菌株活化后,按2%接種量分別接種至pH為3.0和5.0的MRS液體培養基、NaCl添加量為6%和9%的MRS液體培養基中。37 ℃振蕩(100 r/min)培養24 h,按實際情況稀釋,測量其OD600值,重復3次。

1.2.8 人工接種發酵辣椒汁

1.2.8.1 辣椒汁的制備 將燈籠椒清洗干凈,用打漿機打漿,過濾后收集辣椒汁分裝,添加4%的葡萄糖,3%的酵母浸膏,0.2%的磷酸氫二鉀,混合均勻,巴氏殺菌后冷卻備用[16]。

1.2.8.2 接種發酵 將BLHN3、EJT2、PDJ1接種至辣椒汁培養基中,37 ℃恒溫發酵5 d,分別觀察3株菌在5 d內的乳酸菌數、pH及感官評定。

1.2.8.3 乳酸菌數 乳酸菌數采用平板計數法[15]。

1.2.8.4 pH測定 pH采用pH計檢測[12]。

1.2.8.5 感官評價 組織10名經過感官評價培訓的人員,對辣椒汁的色澤、氣味、滋味、辣度進行感官評定,結果取平均值。感官評分標準如表1。

表1 感官評分標準

1.2.9 揮發性成分的測定

1.2.9.1 樣品前處理 將固相微萃取頭在溫度為270 ℃的氣相色譜儀進樣口老化30 min,吸取發酵5 d的辣椒汁5 mL于頂空樣品瓶中,密封后60 ℃恒溫10 min,將老化后的萃取頭插入樣品瓶中,纖維頭位于液面上約1.5 cm,以900 r/min的速度攪拌,吸附40 min。再將萃取頭插入氣相色譜儀的進樣口,解吸5 min,啟動儀器和采集數據[17]。

1.2.9.2 GC/MS條件 氣相色譜條件[18]:色譜柱采用DB-5MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);高純氦氣(99.999%)作為載氣,流速1.0 mL/min;進樣口溫度250 ℃;不分流進樣;程序升溫,柱溫50 ℃,保持1 min,以8 ℃/min升溫至290 ℃,保持2 min。

質譜條件:離子源溫度為200 ℃,接口溫度為220 ℃,電離方式EI,電子能量為70 eV,燈絲電流為150 μA,質核比掃描范圍在45～500 m/z。定性定量方法:對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對NIST 08和Wiley 275標準質譜圖,確定揮發性化學成分,面積歸一化法進行定量分析揮發性風味物質中的相對含量。

1.3 數據處理

所有實驗3次重復,結果以“平均值±標準差”表示,采用SPSS 17.0對數據進行分析,單因素方差分析進行顯著性差異分析,P<0.05為差異顯著;采用Origin 8.5繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 高效產酸乳酸菌的篩選

以自制的剁辣椒為原料,通過分離純化,鏡檢和接觸酶實驗,共得到54株乳酸菌。比較各菌株發酵液的OD600值和pH,初篩得到產酸能力較強的BLHN3、CL7-3、DC2、EJT2、EJT5、HG3、JCC6、JCT3、PDJ1、XM2、XY28-3等11株菌,OD值均在1.0以上,pH均小于4.5。由圖1可知,乳酸菌BLHN3、EJT2、PDJ1的發酵液總酸顯著高于其他菌株(P<0.05),其中菌株BLHN3和PDJ1的總酸最高且差異不顯著(P>0.05),分別為1.34%和1.31%。

圖1 不同乳酸菌產酸性能的比較

2.2 形態學鑒定

由圖2可以看出,BLHN3菌株的菌落呈圓形,光滑濕潤,白色,邊緣整齊,易挑起,Φ為1～2 mm;細胞形態為桿狀;EJT2菌株的菌落呈圓形,光滑濕潤,乳白色,邊緣整齊,易挑起,Φ為1～2 mm;細胞形態為桿狀;PDJ1菌株的菌落呈圓形,光滑濕潤凸起,白色,邊緣整齊,易挑起,Φ為1～3 mm;細胞形態為桿狀。3株菌符合乳桿菌的形態學特征。

圖2 乳酸菌形態及顯微鏡觀察(1000×)

2.3 分子生物學鑒定

用濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析DNA基因組的PCR產物,電泳圖如圖3所示,3株菌的擴增序列長度均為1448 bp。

圖3 PCR產物檢測電泳圖

將所得的堿基序列在NCBI的BLAST上比對,用MEGA 4.0構建系統發育樹進行同源性分析,結果如圖4所示,3株菌在系統發育樹上處于同一分支,均與發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)的相似度最高,同源性分別為99.93%、100.00%和99.93%。16S rRNA基因序列比對中,屬于同一個屬的最低同源性為95%,屬于同一個種的最低同源性為97%,可以判定3株菌均為L.fermentum。

圖4 菌株BLHN3、EJT2和PDJ1的16S rDNA系統發育樹

2.4 優良乳酸菌生物學特性生長曲線

由圖5和圖6的生長曲線可以看出,BLHN3、EJT2、PDJ1三株菌均在約6 h進入對數生長期,14 h進入平穩期,菌株BLHN3和EJT2生長速率相當,菌株PDJ1生長速率相對較快。3株菌的活菌數從一開始迅速增大,在14 h時達到高峰,此后活菌數不再增加,緩慢下降,進入衰退期。

圖5 菌株的生長曲線

圖6 菌株的生長曲線

2.5 耐酸性

從圖7可看出,在pH5培養環境中,3株菌的生長情況基本相似,在培養8 h時,PDJ1的OD600 nm值高于EJT2和BLHN3兩株菌。培養24 h后,3株菌的OD600 nm值基本接近,在1.6左右。

圖7 分離菌株在pH5酸性條件下的生長曲線

剁辣椒發酵后期,酸度的升高會對乳酸菌產生抑制作用。從圖8可以看出,相對于條件pH5,pH3生長環境下3株菌的生長受到明顯抑制,生長較緩慢,PDJ1相對于其它兩株菌受到的抑制作用較小。說明pH越低,乳酸菌的生長受到抑制越明顯,這和葉陵等[12]研究的趨勢一致。

圖8 分離菌株在pH3酸性條件下的生長曲線

2.6 耐鹽性

辣椒發酵需要添加食鹽,形成高滲透壓環境,抑制辣椒攜帶的有害微生物。由圖9可知,在6% NaCl的滲透壓環境下,3株菌的生長均受到不同程度的抑制。EJT2菌株和BLHN3菌株前6 h基本沒有生長,在培養10 h后生長速率加快。PDJ1菌株呈緩慢生長趨勢,耐鹽能力相對較強。

圖9 6% NaCl脅迫下分離菌株的生長曲線

NaCl含量越高,滲透壓越強;菌株OD值越大,抗滲透壓能力越強。由圖10可知,在9% NaCl的滲透壓環境下,菌株EJT2和BLHN3前10 h生長受抑制,PDJ1緩慢生長,且OD值和在6% NaCl的環境中相差不大,證明PDJ1對NaCl具有相對較強的抗滲透壓能力。

圖10 9% NaCl脅迫下分離菌株的生長曲線

2.7 優良乳酸菌發酵辣椒汁品質特性

2.7.1 發酵過程中乳酸菌數 除原料本身特有風味外,乳酸菌的代謝也有很大影響,對發酵后的辣椒汁進行乳酸菌計數測定,如圖11所示,三株菌株發酵的辣椒汁中活菌數變化趨勢大體一致,在3 d內的乳酸菌數呈逐漸升高的趨勢,發酵第3～5 d乳酸菌數有所下降,說明乳酸菌數達到一定值時,培養基提供的營養物質不能滿足菌株繼續增殖,導致發酵后期乳酸菌數減少。PDJ1在3 d時活菌數最高達到106CFU/mL,之后活菌數略有下降,EJT2略低于PDJ1。

圖11 乳酸菌數的變化

2.7.2 發酵過程中pH變化 pH是用來衡量產品是否發酵成熟的重要標志之一,由圖12可知,PDJ1、EJT2、BLHN3菌株的pH均逐漸下降,說明乳酸菌發酵產生乳酸導致pH下降。1～2 d內三株菌的pH下降迅速,原因是純菌種接種發酵,快速主導發酵過程,產生大量乳酸,pH下降幅度更大[19]。第3～5 d pH下降速度減慢,趨于平穩。原因是乳酸菌發酵后期酸度增高對其抑制作用較大,造成乳酸菌部分死亡。PDJ1發酵辣椒汁的pH下降趨勢明顯,PDJ1菌株產酸能力更強。

圖12 pH的變化

2.7.3 發酵辣椒汁感官評價 由圖13可知,BLHN3和PDJ1菌株發酵的辣椒汁在香氣和滋味特征方面較為突出,香氣濃郁,辣度適中,綜合感官評分高;EJT2菌株發酵的辣椒汁具有較好的香氣,滋味特征不顯著,辣度適中,綜合感官評分較低。因此BLHN3和PDJ1發酵的辣椒汁香氣較顯著,適宜作為剁辣椒加工的發酵菌株。

圖13 菌株發酵辣椒汁的感官評價雷達圖

2.7.4 發酵辣椒汁揮發性香氣成分分析 采用GC-MS對發酵5 d后的辣椒汁進行揮發性成分檢測,由表2可知,BLHN3菌株檢測出6類37種,EJT2菌株檢測出6類28種,PDJ1菌株檢測出6類34種。BLHN3和PDJ1菌株發酵的辣椒汁中主要香氣成分是酯類、醇類和烯烴類,EJT2菌株發酵的辣椒汁中主要香氣成分是酯類、醇類。

表2 發酵辣椒汁揮發性成分GC-MS分析結果

續表

發酵的辣椒汁中醇類物質有9種,大都具有令人愉快的香氣,對辣椒的揮發風味作用很大[20]。醇類物質占比PDJ1(31.49%)>EJT2(28.62%)>BLHN3(24.66%),共有組分有(E)-2-己烯-1-醇、苯乙醇、香葉醇。PDJ1發酵的辣椒汁中(E)-2-己烯-1-醇和香葉醇相對含量最高,分別占23.60%、1.26%。(E)-2-己烯-1-醇具有強烈的果香-青香香氣;香葉醇具有溫和、甜的玫瑰花氣息;苯乙醇具有淡雅玫瑰氣味,即使濃度低也能呈現很高的玫瑰氣味[17]。BLHN3和PDJ1的相對含量大于EJT2的相對含量。

酯類是辣椒汁的主要香氣成分,本實驗發酵辣椒汁中酯類物質有10種,BLHN3菌株發酵的辣椒汁中酯類相對含量在3組中最高占33.37%,具有令人愉悅的香氣。且共有組分相對含量也最高,共有組分有亞油酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯。亞油酸乙酯具有降血脂功效,BLHN3、EJT2、PDJ1菌株發酵的發酵汁分別占2.18%、1.26%、1.98%。乙酸乙酯相對含量分別達14.42%、13.21%、13.09%,有清靈、微帶果香的酒香。辛酸乙酯有白蘭地酒香味[17],BLHN3菌株發酵的辣椒汁中相對含量最高占3.43%。韓江雪等[21]用發酵乳桿菌發酵辣椒產生的酯類物質僅為5種。

烴類物質有10種,烷烴類3種,烯烴類7種,烷烴類賦予辣椒汁香氣較小[22],且易氧化變質,本實驗中三株菌發酵的辣椒汁產生的烷烴類物質均比前人研究[17]少。烯烴類物質閾值較低,是辣椒中的主要呈味物質[23],發酵后相對含量越多,辣椒汁的香味更濃郁,BLHN3和PDJ1菌株發酵的辣椒汁中烯烴類物質含量分別達6.67%和8.94%,而EJT2菌株發酵的辣椒汁中僅2.56%。共有組分D-檸檬烯具有令人愉快的檸檬香味[24],PDJ1發酵辣椒汁的D-檸檬烯相對含量最高占2.50%。

本實驗的揮發性成分中共有醛類物質3種,酮類物質9種,6種酸類物質。醛類物質的香氣較濃烈,感官閾值較低,有花香和果香氣味[25]。三株菌發酵的辣椒汁中共有成分苯乙醛有類似風信子的香氣,稀釋后具有水果的甜香氣,在辣椒相關研究[17,26]中未見報道。酮類物質性質穩定、香味持久。BLHN3菌株和PDJ1菌株發酵的辣椒汁中苯乙酮有山楂氣味,EJT2菌株發酵的辣椒汁中未檢出苯乙酮。酸類物質含量過高會使辣椒汁口感偏酸,導致風味不足[24]。EJT2菌株發酵的辣椒汁中醋酸含量達2.32%,具有刺激性氣味,發酵辣椒汁風味較差。共有組分辛酸含量較高,略有不舒適的氣味,稀釋后呈水果香氣。

綜合考慮,相較于EJT2菌株,BLHN3和PDJ1菌株是發酵辣椒汁的產香能力較好的菌株,可制成發酵劑應用于剁辣椒加工。

3 結論與討論

從傳統自然發酵的辣椒中篩選出3株高效產酸的乳酸菌,經鑒定均為發酵乳桿菌。PDJ1菌株的生長速率相比EJT2和BLHN3較快,且耐酸耐鹽能力最強;3株菌接種于辣椒汁發酵后品質分析發現,PDJ1菌株發酵的辣椒汁在3 d時活菌數最高,pH下降趨勢明顯,產酸能力更強;采用GC-MS技術分析:BLHN3和PDJ1菌株發酵的辣椒汁產生的呈香物質相對含量較多,結合感官評價,BLHN3和PDJ1菌株發酵辣椒汁相對EJT2菌株風味較突出,產香性能較好。

在肉制品、發酵乳制品、豆制品、發酵蔬菜等發酵食品中,發酵乳桿菌不僅是優勢乳酸桿菌,且發揮著特有的發酵作用[27]。研究表明,發酵乳桿菌普遍都具有益生性,如胃腸道環境的適應能力[27]、膽固醇的降解能力[28]、有抗菌能力[29]、免疫調節[30]、抗氧化能力[31]等。本實驗證實發酵乳桿菌對不良環境具有強耐受能力,與前人研究一致[32]。發酵乳桿菌屬于異型發酵乳酸桿菌,代謝產物非常豐富,使得發酵制品的感官和風味較同型發酵乳酸桿菌更獨特。通過GC-MS對發酵的辣椒汁揮發性物質分析,BLHN3和PDJ1菌株發酵的辣椒汁中主要香氣成分是酯類、醇類和烯烴類,EJT2菌株發酵的辣椒汁中主要香氣成分是酯類、醇類。相對含量不同所產生的香氣各具差異,BLHN3菌株發酵的辣椒汁中產生的亞油酸乙酯、乙酸乙酯和辛酸乙酯相對含量最高,賦予辣椒汁愉悅的香氣。PDJ1菌株產生的呈香物質如(E)-2-己烯-1-醇、香葉醇、D-檸檬烯相對含量最高,賦予辣椒汁果香、清香。烯烴類物質閾值較低,BLHN3和PDJ1菌株發酵的辣椒汁中烯烴類物質含量分別達6.67%和8.94%,使辣椒汁的香氣更濃郁。結合感官評價,BLHN3和PDJ1菌株發酵辣椒汁相對EJT2菌株風味較突出,目前對發酵乳桿菌在發酵食品中的作用研究較少,可為工業化生產提供參考。因此,下一步工作將研究發酵乳桿菌在剁辣椒加工過程中的應用及其益生性。