利用HPLCDADESI/ITTOF/MSn分析不同品種藍莓果實的花青素結構

韓 雪,袁瑋瓊,武 藝,劉東偉,牟一晗,敖 璇,呂兆林

(1.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083;2.北京林業大學公共分析測試中心,北京 100083;3.林業食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

藍莓(Sementrigonellae)學名越桔,杜鵑花科越桔屬,是一種經濟價值較高的新興漿果[1-3],藍莓果營養豐富,富含花青甙、熊果甙、VE、VA等,故有“漿果之王”稱號[4-6]。有研究表明,藍莓具有多種保健功能,如改善視力、增強人體免疫力、預防心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抑菌、抗癌等[7-8]。

藍莓出色的保健功能主要取決于其富含的花青素成分。花青素是一種次生代謝產物,是黃酮類化合物中最重要的種類[9-13]。它具有較強的抗氧化活性,可預防多種癌癥和動脈內斑塊的形成,也可降低心臟疾病的患病率,延緩器官老化。另外花青素可激活人體內的免疫系統,增強機體免疫力,防止免疫蛋白受自由基侵害,還具有減輕眼疲勞、提高夜間視力的功能[14-15]。因此,快速檢測藍莓果中復雜且未知花青素類化合物成為近年來的研究熱點。

有研究者利用紫外光譜(Ultraviolet visible spectrum,UV)測定藍莓中花青素的含量,這種方法只能測定花青素的總量,不能確定花青素結構[16];也有學者將花青素提取物經柱層析、制備色譜、大孔樹脂吸附等方法分離純化,再采用核磁共振法、紅外光譜法等之后利用儀器分析可以達到鑒定結構的目的,此種研究手段的前處理過程復雜、費時、定量分析困難,且不容易得到微量及痕量級化合物的結構信息[17-19]。目前,液質聯用技術被認為是快速、準確檢測花青素結構及含量的優良方法[20-24]。液質聯用技術有兩大分類系統,從質譜的離子源類型劃分,可分為電噴霧離子源、大氣壓化學電離源、大氣壓光電離源和基質輔助激光解吸電離源等;從質譜的質量分析器角度劃分,可分為四極桿、離子阱、飛行時間和傅立葉變換質譜等[25]。其中飛行時間(Time-of-flight,TOF)與質譜(Mass spectrometer,MS)聯用或與串聯質譜儀聯用,可將TOF分離不同質量分子的能力與MS的結構表征能力有效地結合,是表征天然化合物結構的有力工具[26]。近年來,液相色譜電噴霧離子源與混合離子阱和高分辨率飛行時間質譜的聯用,已成功應用于分離和表征多種化合物[27-28]。

本實驗采用HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn技術,對埃利奧克(Elliott)、愛國者(Patriot)、北藍(Northblue)、北陸(Northland)、杜克(Duke)、藍豐(Bluecrop)6個品種藍莓中的花青素結構進行研究,利用紫外可見光譜及多級質譜數據鑒定6種藍莓花青素的結構,建立一種快速檢測花青素的方法,解決了花青素標準品難以獲得的問題,為鑒定不同品種藍莓中花青素的結構差異,快速獲取藍莓中花青素的種類及結構提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓 丹東食品有限公司購入,品種分別為埃利奧克(Elliott)、愛國者(Patriot)、北藍(Northblue)、北陸(Northland)、杜克(Duke)、藍豐(Bluecrop);無水甲醇、鹽酸 分析純,北京化工廠;乙腈、甲酸 色譜純,美國賽默飛世爾科技有限公司。

HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn二極管陣列高效液相色譜-電噴霧離子阱-飛行時間串聯多級質譜儀 日本島津公司;Zorbax SB C18柱、LXJ Ⅱ離心機 上海民用分析儀器廠;98-1-B型電子調溫電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓花青素的提取 采用劉亞等[15]的方法稍作改進提取藍莓果中的花青素。準確稱取2.0 g藍莓果泥置于圓底燒瓶中,按固液比1∶15 g/mL加入50%甲醇水溶液回流提取1 h,提取溫度為80 ℃,將提取液于8000 r/min下常溫離心10 min,收集上清液,用0.25 μm的微孔濾膜過濾,利用HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn對藍莓果實花青素的種類及結構進行分析。

1.2.2 HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn分析

1.2.2.1 液相色譜條件 色譜柱:Zorbax SB C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm);流動相組成:流動相A為5%甲酸水溶液,流動相B為乙腈;梯度洗脫程序:0 min,A:90%;0～10 min,A:80%;10～15 min,A:80%;15～25 min,A:50%;25～30 min,A:40%。檢測波長520 nm;流速1 mL/min;恒溫柱箱溫度30 ℃;進樣體積5 μL;波長掃描210～700 nm。

1.2.2.2 質譜條件 采用正離子模式;電壓3.5 kV;CDL溫度200 ℃;加熱部件200 ℃;霧化氣(N2)1.5 L/min;干燥氣壓(N2)0.1 MPa。一級質譜離子掃描范圍m/z 200～1500;二級質譜離子掃描范圍m/z 100～1500;三級質譜離子掃描范圍m/z 50～1500。使用自動模式搜集數據,氬氣作為碰撞氣體,二級和三級質譜能量設置均為50%。

1.2.3 化合物鑒定 參考Lv等[26]的方法,通過HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn測試,獲取相關數據,對6種藍莓提取液中的花青素結構及種類進行鑒定。

花青素組分在210～550 nm UV波長范圍內存在兩種主要吸收,吸收帶Ⅰ為270～280 nm,吸收帶Ⅱ為520～530 nm。基于DAD紫外光譜掃描,篩選出具有花青素特征吸收的化合物。

確定具有花青素UV特征光譜的組分對應的母離子的準確分子量。

通過Formula Predictor 4.2軟件檢索花青素化合物的分子式。為確保預測化合物的分子式準確性,測量的分子離子與預測分子式之間的質量差異應低于5 ppm。

根據花青素化合物的質譜裂解規律,確定組分的糖苷配基類型、糖基類型及糖基取代類型,從而推測出藍莓花青素結構。

1.3 數據處理

所有實驗重復測定三次,采用Origin 8.5進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 六種藍莓花青素結構分析

利用Formula Predictor 4.2軟件對6種不同品種的藍莓提取液中的花青素結構進行檢索,得到5種不同的苷元結構,如下圖1所示。

圖1 五種游離花青素的分子結構

2.1.1 以矢車菊素為苷元的花青素 矢車菊素(Cyanidin)在苷元上3、5、7、4′、5′位連接五個羥基而成,質譜分析得到離子碎片基峰為m/z 287;6種藍莓中均鑒定出矢車菊素。

2.1.2 以花翠素為苷元的花青素 花翠素(Delphinidin)在矢車菊素的基礎上3′位多鏈接一個羥基,質譜分析得到離子碎片基峰為m/z 303,特征離子包括m/z 262、m/z 172;6種藍莓中均鑒定出花翠素。在藍莓提取液中還測得兩種具有典型的花青素類化合物UV光譜圖的物質,分析這兩類化合物的MS及MS/MS數據。其中一種化合物與花翠素苷元的分子離子相比,其分子量相差大約為162,由Formula Predictor 4.2軟件推測該化合物與花翠素相差1個[C6H10O5]單糖單元,經查閱文獻鑒定該花青素為花翠素-3-O-半乳糖配基[29],測得埃利奧特藍莓、北陸藍莓、杜克藍莓含有該類化合物。另一種化合物與花翠素的分子離子相比,其分子量相差大約為132,由軟件推測該化合物與花翠素相差1個脫水的[C5H8O4]單糖單元,經查閱文獻得該花青素為花翠素-3-O-阿拉伯糖配基[29],測得含有該花青素的藍莓品種是埃利奧特、愛國者、北陸、藍豐。

2.1.3 以牽牛花色素為苷元的花青素 牽牛花色素(Petunidin)在苷元上3、5、7、3′、4′位連接五個羥基,4′位連接一個甲氧基而成,質譜分析得到離子碎片基峰為m/z 317,特征離子包括m/z 302、m/z 274;6種藍莓中檢測到牽牛花色素的有埃利奧特藍莓、愛國者藍莓、北藍藍莓、北陸藍莓、杜克藍莓。

在藍莓提取液中還檢測到兩種具有典型的花青素類化合物UV光譜圖的物質,分析這兩類化合物的MS及MS/MS 數據。第一種物質與牽牛花色素的分子離子相比,其分子量相差大約162,由軟件推測該化合物與牽牛花色素相差1個[C6H10O5]單糖單元,查閱文獻鑒定該花青素為牽牛花色素-3-O-半乳糖配基或牽牛花色素-3-O-葡萄糖配基[29],但由于兩種物質出峰時間不同,牽牛花色素-3-O-半乳糖配基色譜峰的保留時間早于牽牛花色素-3-O-葡萄糖配基色譜峰,因此,此化合物為牽牛花色素-3-O-半乳糖配基,測得含有此化合物的藍莓品種有:北藍藍莓、北陸藍莓、豐藍藍莓。另一種化合物與牽牛花色素的分子離子相比,其分子量相差大約為132,由軟件推測出的化合物分子式與牽牛花色素相差1個脫水的[C5H8O4]單糖單元,查閱文獻得該物質為牽牛花色素-3-O-阿拉伯糖配基[29],該花青素在埃利奧特、愛國者、北陸、杜克藍莓中可檢測到。

2.1.4 以芍藥素為苷元的花青素 芍藥素(Peonidin)則在苷元上3、5、7、4′位連接四個羥基,5′位連接一個甲氧基而成,質譜分析得到離子碎片基峰為m/z 301,特征離子包括m/z 286、m/z 258;6種藍莓中檢測出芍藥素的品種是埃利奧特藍莓、愛國者藍莓。

2.1.5 以錦葵色素為苷元的花青素 錦葵色素(Malvidin)在苷元上3、5、7、4′位連接四個羥基,3′、5′位連接兩個甲氧基而成,質譜分析得到離子碎片基峰為m/z 331,特征離子包括m/z 299、m/z 287。6種藍莓中檢測出錦葵色素的品種是:埃利奧特、愛國者、北陸、杜克、北藍。

在藍莓提取液中還測得一些具有典型的花青素類化合物UV光譜圖的物質,對這些化合物的MS及MS/MS數據進行分析。第一種化合物與錦葵色素的分子離子相比,其分子量相差大約162,由軟件推測該化合物與錦葵色素相差1個[C6H10O5]單糖單元,查閱文獻得該花青素為錦葵色素-3-O-半乳糖配基或錦葵色素-3-O-葡萄糖配基[29],但由于兩個物質出峰時間不同,錦葵色素-3-O-半乳糖配基先于錦葵色素-3-O-葡萄糖配基出峰,故鑒定出峰早的化合物為錦葵色素-3-O-半乳糖配基,出峰晚的化合物錦葵色素-3-O-葡萄糖配基,檢測出含有錦葵色素-3-O-半乳糖配基的藍莓品種是埃利奧特、愛國者、北陸、杜克、北藍;含有錦葵色素-3-O-葡萄糖配基的品種是北陸、杜克、豐藍。另一種物質與錦葵色素的分子離子相比,其分子量相差大約132,由軟件推測該化合物與錦葵色素相差1個脫水的[C5H8O4]單糖單元,查閱文獻得該花青素為錦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基[29],鑒定出含有該花青素的種類為埃利奧特、愛國者、杜克、北藍、豐藍。

2.2 六種藍莓花青素結構鑒定

6種不同品種藍莓中的花青素通過HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn被分析鑒定出來,根據上述分析,將不同品種藍莓提取液的液相總離子流圖,以及鑒定出的花青素種類和它們對應的化合物UV 光譜數據、一級質譜數據、二級質譜數據匯總,如表1～表6所示,不同藍莓品種的色譜圖如圖2～7所示。

圖2 埃利奧特藍莓花青素提取物的色譜圖

圖3 愛國者藍莓花青素提取物的色譜圖

圖4 北藍藍莓花青素提取物的色譜圖

圖5 北陸藍莓花青素提取物的色譜圖

圖6 杜克藍莓花青素提取物的色譜圖

圖7 藍豐藍莓花青素提取物的色譜圖

表1 埃利奧特藍莓花青素提取物HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn數據及化合物鑒定結果

表2 愛國者藍莓花青素提取物成分特性

表3 北藍藍莓花青素提取物成分特性

表4 北陸藍莓花青素提取物成分特性

表5 杜克藍莓花青素提取物成分特性

表6 藍豐藍莓花青素提取物 成分特性

2.3 不同品種藍莓花青素組成

將6個品種的藍莓檢測到的花青素種類歸納,埃利奧特藍莓共測得11種花青素,愛國者藍莓10種,北藍藍莓7種,北陸藍莓12種,杜克藍莓9種,藍豐藍莓6種。由圖8可知,北陸藍莓檢測到的花青素種類最多,達12種;埃利奧特和愛國者藍莓中檢測到的花青素種類也很豐富,分別達到11和10種;藍豐藍莓中檢測到6種。

圖8 不同品種藍莓花青素個數對比

從花青素的組成上看,由表7可知,花翠素和矢車菊素這兩種花青素在6種藍莓中均被檢出;帶糖配基的錦葵色素-3-O-半乳糖配基、錦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基、牽牛花色素以及錦葵色素在埃利奧特、愛國者、北藍、北陸、杜克5種藍莓中均檢測到;藍豐藍莓中未檢測到錦葵色素-3-O-半乳糖配基,牽牛花色素和錦葵色素;錦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基在北藍藍莓中沒有檢測到;芍藥素只在埃利奧特和愛國者藍莓中被檢測出來。

表7 不同品種藍莓花青素組成

3 結論

本文利用HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn對埃利奧克、愛國者、北藍、北陸、杜克、藍豐6種不同品種的藍莓花青素進行對比分析,結合紫外可見光譜及多級質譜數據對花青素的結構進行鑒定,建立了一種實用、快速且準確鑒定藍莓花青素種類的多級質譜液質聯用方法。

藍莓的品種不同,含有的花青素種類、結構均存在顯著差異。從花青素種類分析,6種藍莓中共測得花青素13種,其中北陸中檢測到的花青素種類最多,共12種,包括花翠素、矢車菊素、牽牛花色素、錦葵色素4種花青素苷元以及花翠素、牽牛花色素、錦葵色素與糖基的衍生物8種;埃利奧特和愛國者的花青素種類也較為豐富,分別測得11種和10種,包括花翠素、矢車菊素、牽牛花色素、錦葵色素、芍藥素5種花青素苷元以及花翠素、牽牛花色素、錦葵色素與糖基的衍生物;北藍藍莓測得7種,杜克藍莓鑒定出9種,藍豐藍莓中檢測到的種類較少,只有6種。從花青素的組成分析,以不聯接糖苷的花翠素和矢車菊素在藍莓中分布最廣泛,所有品種中均可檢測到。除花翠素、矢車菊素外,不聯接糖苷的錦葵色素和牽牛花色素以及帶有糖配基的錦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基和錦葵色素-3-O-半乳糖配基也分布較廣。其中不聯接糖苷的錦葵色素和牽牛花色素以及錦葵色素-3-O-半乳糖配基在除藍豐品種外的其它5個品種中均檢測到,帶有糖配基的錦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基可在埃利奧克、愛國者、北陸、杜克、藍豐5個藍莓品種中檢測到。含有芍藥素的藍莓品種較少,只在埃利奧克、愛國者品種中檢測到。

藍莓花青素與其他植物的花青素相比,具有小分子、更易吸收的優點,同時因其出色的保健功能,成為近年來研究者和藍莓產品市場的關注熱點。目前針對多品種藍莓花青素結構及種類的研究較少,本文章利用HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn技術建立的分析測試方法可以快速、準確地鑒定出藍莓花青素種類,亦可為選育花青素種類豐富的藍莓品種及后續藍莓花青素產品的開發與深加工提供數據參考。