基于異源包被的曲安奈德競爭酶聯免疫檢測方法

王英姿,閆劍勇,張世偉

(1.中華人民共和國江門海關,廣東江門 529000;2.深圳市計量質量檢測研究院,廣東深圳 518000)

曲安奈德(Triamcinolone acetonide,TCA)是一種常見的糖皮質類激素,具有抗炎癥、抗過敏、抗增生等作用,在臨床上常被用于治療過敏、皮膚炎癥、哮喘等疾病,但長時間過量使用可能引起嚴重的副作用,比如引起高血壓、糖尿病、骨質疏松、過敏性皮炎、柯興氏綜合征、永久性皮膚萎縮和膿皰型銀屑病等疾病[1-2]。同時,糖皮質類激素還具有促進機體非正常生長的作用,可大幅提高動物的生長速度,因此常被不法養殖戶大量用于經濟動物的養殖,這些濫用行為會致使糖皮質類激素在動物體內存在不同程度的殘留,人若長期食用糖皮質類激素殘留的食物可能會導致機體代謝紊亂。更有一些商販在保健食品或中藥材直接添加糖皮質類激素,消費者在食用此類保健食品或藥品后短期內雖會出現積極效用,倘若長期攝入將嚴重危害消費者的健康[3-5]。然而在暴利的驅使下,非法濫用糖皮質激素的情況時有發生[6-7]。針對糖皮質類激素濫用的情況,我國的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》(農業部2002年235號公告)[8]中對動物源性食品中各類糖皮質類激素殘留最高限量值進行了的規定。

現常用的糖皮質類激素檢測方法主要為氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用和液相色譜-質譜聯用等方法[9-11],這些方法均需要大型設備儀器,不僅對于食品前處理有一定要求,檢測的時效性也缺乏保障,因此建立一種簡單、可靠的快速檢測方法來應對大量樣品檢測任務具有重要應用價值。

糖皮質類激素的種類較多,常見的包括氫化可的松、可的松、地塞米松、曲安奈德、丙酸氯倍他索、倍他米松、潑尼松和潑尼松龍等,這些糖皮質類激素具有類似的母環結構,也具有不同程度但作用相似的抗炎和促進非正常生長等作用。許多研究發現基于異源策略的酶聯免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)可以顯著提高小分子檢測的靈敏度[12-14]。本實驗通過篩選得到曲安奈德的單克隆抗體,分別采用同源和異源兩種策略間接競爭ELISA(indirect competitive ELISA,ic-ELISA)對所得抗體進行靈敏度檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

孔戚血藍蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)、卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG) 美國Sigma公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 源葉生物公司;免疫佐劑 北京博奧龍免疫技術有限公司;糖皮質激素標準品:TCA、地塞米松(Dexamethasone,DEX)、可的松(Cortisone,COR)、氫化可的松(Hydrocortisone,HYD)等 百靈威科技有限公司;喂養實驗動物的曲安奈德藥物為醫用曲安奈德注射液(40 mg/mL) 昆明積大制藥股份有限公司;純牛乳 中國伊利集團;PBS(pH7.4,0.2 g/L KH2PO4,2.9 g/L Na2HPO4·H2O,0.2 g/L KCl,8.5 g/L NaCl)、PBS-T(含0.05% Tween20的PBS)、包被液(pH9.6,0.75 g/L Na2CO3,1.46 g/L NaHCO3)、封閉液(5%脫脂奶粉溶解于PBS)、BCA蛋白濃度檢測試劑盒 湖南艾佳生物科技;高糖DMEM細胞培養基(DMEM-GlutaMAX)、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)、青霉素-鏈霉谷-氨酰胺混合液(Penicillin-Streptomycin-Glutamine,100)、HAT添加劑(50)、HT添加劑(100) 美國Gibco公司;HRP標記山羊抗鼠IgG 美國Arista Biologicals公司、ELISA酶標板 美國Corning公司;小鼠骨髓瘤細胞SP2/0 本實驗室保存;6～8周齡雄性SPF級Balb/c小鼠 廣東省醫學動物實驗中心;家雞 當地市場。

SynergyH1酶標儀、96孔酶聯免疫洗板機 美國Biotek公司;Evolution260紫外可見光分光光度計 美國Thermo公司;1260Infinity高效液相色譜 德國安捷倫公司;Triple Quad 5500三重四級桿質譜 新加坡AB SCIEX公司;超純水機 美國Merck millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖皮質激素半抗原和抗原的合成 糖皮質激素半抗原合成路線如圖1所示。取糖皮質激素(曲安奈德、地塞米松、可的松或倍他米松)1 mmol、丁二酸酐1.4 mmol于50 mL圓底燒瓶中,加入無水吡啶5 mL,混合后在60 ℃下反應8 h,停止加熱后冷卻至室溫,將反應物轉移至20 mL 10%的HCl冰水浴中,有大量白色沉淀析出,過濾后用去離子水洗滌數次,干燥后得半抗原白色固體,產率在65%～80%之間。

圖1 免疫半抗原和包被半抗原的合成

完整抗原參考文獻[15]利用活潑酯法進行合成,免疫抗原為曲安奈德半抗原TCA-COOH與KLH的偶聯物。包被抗原為曲安奈德、地塞米松、可的松或氫化可的松半抗原與BSA的偶聯物,分別命名為TCA-BSA、DEX-BSA、COR-BSA、HYD-BSA。偶聯物透析72 h后使用紫外分光光度計對抗原進行鑒定,掃面波長190～340 nm,分別以半抗原和載體蛋白作為對照,觀察最大吸收峰的變化。BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定其濃度后-20 ℃保存備用。

1.2.2 單克隆抗體制備 按照《抗體實驗手冊》中的方法建立雜交瘤細胞株[16]。TCA-KLH作為免疫原,經小鼠免疫、細胞融合、篩選能穩定分泌曲安奈德單克隆抗體的細胞株。采用動物體內生產法制備腹水單抗。

1.2.3 ic-ELISA方法 每孔加包被原100 μL 4 ℃孵育過夜。第二天倒掉包被液,用洗滌液洗一遍,每孔再加200 μL封閉液,37 ℃孵育3 h,倒掉封閉液。每孔加50 μL單克隆抗體和50 μL樣品(或標準溶液),陰性對照孔用PBS代替,37 ℃反應30 min,完后用PBS-T洗3次。再加入100 μL HRP標記山羊抗鼠IgG,37 ℃反應30 min,之后用PBS-T洗3次。加底物顯色液37 ℃反應10 min,稀H2SO4終止反應后上酶標儀檢測。以曲安奈德濃度為橫坐標,B/B0為縱坐標繪制標準曲線(B為樣品或標準品的吸光度值,B0為空白溶液的吸光度值)。同時,采用棋盤法試驗優化包被抗原和酶標抗體的最佳稀釋倍數。

1.2.4 交叉反應測定 使用25種糖皮質激素分別建立標準曲線,通過計算IC50評估ELISA方法對各糖皮質激素的交叉反應。

1.2.5 添加回收檢測 首先使用TAYLOR報道的 HPLC-MS/MS方法確證所選用的豬肝和豬肉樣品不含有曲安奈德[17]。分別在1 g樣品加入曲安奈德標液至2和20 μg/kg,4 ℃放置12 h使組織充分吸收所添加的藥物。加入5 mL 20%甲醇水溶液(v/v)。振蕩混勻5 min后4000 r/min離心,取上清進行ELISA檢測。

1.2.6 真實樣品測定 在飼料里混入終濃度為10 mg/kg的曲安奈德連續喂養家雞3 d,宰殺后取肝、腎、肌肉,分別使用本方法和TAYLOR報道的HPLC-MS/MS方法進行比對檢驗[17]。

1.3 數據處理

使用Origin 7.5 四參數擬合法繪制標準曲線并計算方法的IC50。

2 結果與分析

2.1 抗原的紫外吸收光光譜表證

半抗原、載體蛋白和抗原的吸收光光譜圖如圖2所示。半抗原DEX-COOH和TCA-COOH含共軛雙鍵且不含苯環,紫外最大吸收波長比載體蛋白偏小20 nm左右,半抗原連接到載體蛋白后形成的全抗原紫外吸收發生了藍移,最大吸收波長大于半抗原而小于載體蛋白,說明全抗原偶聯成功[18]。

圖2 半抗原、載體蛋白和全抗原紫外掃描圖譜

2.2 同源及異源策略ic-ELISA檢測

ic-ELISA反應過程需要游離的藥物和包被在酶標板上的包被原進行競爭,采用異源包被,降低抗體和包被抗原的親和性,從而可相對性的提高抗體和游離藥物的結合能力,使得游離藥物在低濃度下仍然保持競爭優勢[19]。因此,設計理想的異源包被抗原,成為提高ic-ELISA靈敏度的有效手段。糖皮質激素類藥物結構類似,基本結構特征包括腎上腺皮質激素所具有的C3的羰基、Δ4和17β酮醇側鏈以及糖皮質激素獨有的17α-OH和11β-OH,因此成為研究異源包被的良好對象[20]。

本研究選用地塞米松、可的松、氫化可的松這三種糖皮質激素藥物連接載體蛋白構建異源包被原。根據優化后的抗原抗體工作濃度,分別建立曲安奈德同源和異源策略ic-ELISA的標準曲線,結果如圖3所示,同源策略的曲安奈德半抑制濃度為5.4 ng/mL;異源策略下的最優包被原—地塞米松BSA偶聯物(DEX-BSA)半抑制濃度為0.53 ng/mL。結果表明在異源策略中曲安奈德的檢測靈敏度是同源策略的10倍。

圖3 同源和異源策略ic-ELISA法檢測曲安奈德標準曲線

地塞米松半抗原與曲安奈德半抗原在遠離連接臂的3個六元環上都完全相同,只是在近連接臂的5元環側,曲安奈德連接有一個奈德類藥物典型的二氧戊環,而地塞米松為甲基。這種變化使得藥物和包被原的競爭中,更利于抗體選擇與藥物結合,而沒有藥物存在時抗體依然對包被原保持親和能力。目前,基于最低能量構象的高斯計算和抗原抗體共結晶可以分別從宏觀和微觀層面闡述抗原和抗體的構效關系,為后續識別機制的研究提供了有利的工具[21]。

2.3 方法的特異性

糖皮質激素是一類結構相似的藥物家族,表1展示了該方法檢測其他糖皮質激素的交叉反應。由于奈德類藥物在結構上具有較大相似性,該方法和奈德類的藥物具有交叉反應,不與其他糖皮質激素產生交叉反應,因此該方法可作為奈德類藥物的廣譜篩選方法。圖2表明,該抗體可以結合地塞米松、氫化可的松和可的松構建的包被原,但是在競爭模式下,游離的藥物并未產生抑制,說明基于地塞米松的固相異源包被原,相比于游離藥物具有較強的親和優勢。這種原因可能在于,該抗體具有對半抗原連接臂的親和能力,而游離藥物因為不具備連接臂,其結構相似度低于包被原,因此在競爭中無法獲得抑制能力[22]。

表1 與各糖皮質激素的交叉反應率

2.4 添加回收實驗

糖皮質激素屬于脂溶性藥物。目前,對脂溶性藥物的前處理方法主要采用以下三種方法:一種是直接用與水不互溶的有機溶劑(如氯仿)提取。由于ELISA反應需要在水相中進行,因此該方法需要吹干后再用緩沖液復溶,過程繁瑣。第二種是用可與水互溶的有機溶劑(如甲醇)進行提取,然后稀釋至無影響濃度。這種方法比較簡單,但是需要大比例的稀釋,影響檢測靈敏度。第三種是使用一定比例的有機溶劑和水進行提取,提取液直接用于檢測,但是有機溶劑占比過高,對ELISA反應有影響,占比過低則影響回收率。本研究探索了使用甲醇水對含曲安奈德畜肉的提取效果(圖4)。甲醇濃度超過20%(V/V)后,雖然能得到理想的回收率,但是ELISA吸光度值大幅度降低,說明嚴重影響到抗原抗體結合。20%的甲醇水提取回收率介于75%～90%,滿足檢測需求,且對抗原抗體反應干擾較小。

圖4 使用不同濃度甲醇水時的ELISA吸光度和回收率(n=6)

2.5 方法比對

本研究采用向動物人工喂食曲安奈德藥物的方法獲得曲安奈德陽性組織樣品。如表2所示,ELISA方法和液質法對3個陽性樣品和3個陰性樣品的定性上完全一致。定量上,ELISA方法在檢測肌肉方面穩定性較好,6個平行樣品的相對標準偏差為9.6%,檢測內臟的穩定性低于肌肉,肝和腎的相對標準偏差分別為24%和21%。ELISA測得的數據與液質法相比,偏離度≤38%。上述結果說明本研究所建立的曲安奈德ELISA方法能有效的應用于動物組織中曲安奈德的快速篩查。

表2 兩種方法檢測組織中曲安奈德含量(n=6)

3 結論

本研究首先合成曲安奈德半抗原TCA和多種異源包被原,分別建立同源及異源策略的曲安奈德ic-ELISA方法,發現在異源策略下的靈敏度(0.53 ng/mL)是同源(5.4 ng/mL)的10倍。該異源ic-ELISA法能廣譜特異性的檢測奈德類糖皮質激素,而未見和其他糖皮質激素存在交叉反應。結合20%甲醇水作為樣品提取劑可有效提取肌肉和肝臟中的曲安奈德,回收率在75%～90%之間。本方法檢測真實樣品未發現假陰性或假陽性,定量值與HPLC-MS的偏離度≤38%。由于糖皮質激素是結構類似的藥物家族,構建異源包被原料選擇范圍廣,因此本研究可為提升其他糖皮質激素藥物免疫檢測靈敏度提供參考。