百合多糖的純化及其對腸道菌群失調小鼠的調節作用

趙芷萌,趙 宏,王宇亮,沈 宇,王朝興,孟繁玲,張 曼,張 宇

(佳木斯大學藥學院,黑龍江省新藥創制與藥效毒理學評價重點實驗室,黑龍江佳木斯 154007)

腸道菌群數量眾多、種類豐富,廣泛參與多種生理活動,對人類的健康至關重要[1]。在微生物學研究領域,研究人員發現腸道菌群能夠調節腸道運動和分泌,分解食物中的大分子復合多糖,參與營養物質的消化和吸收,促進并維護免疫系統的正常發育和活動等[2-4]。目前對于治療腸道菌群失調最常用的藥物為抗生素類藥物,隨著抗生素在臨床的廣泛應用,其在殺滅致病菌的同時也影響了正常菌群,因此人們開始尋找具有微生態調節作用的天然物質并進行研究[5]。

百合為百合科植物百合(L.browniiF.E. Brown var.viridulumBaker.)、卷丹(LiliumlancifoliumThunb.)、細葉百合(L.pumilumDC.)的干燥肉質鱗葉,味甘、微寒,全球已發現有至少120個品種,其中55種產于中國[6-8]。百合是國家衛生部審批通過的首批藥食兩用品之一,《中華人民共和國藥典》(2015年版)中所載百合功效是養陰潤肺、清心寧神[9-11]。百合中除含有豐富的淀粉、蛋白質和微量元素等營養物質外,還含有多糖、生物堿、皂苷等多種生物活性成分。

近幾年,隨著微生態學的發展,微生態理論和方法開始被引入中藥的研究中,相關研究表明,植物多糖可以促進腸道粘膜免疫水平、調節腸道微生態菌群、促進腸道健康發育[12-16]。現代藥理研究表明,百合多糖在抗疲勞、抗抑郁、抗菌等方面有很好的療效[17],但有關百合多糖對于腸道菌群失調的調節作用研究較少。要保障多糖藥理作用,首先需保證其有效含量,因此本文通過比較AB-8、D315、D101、HPD-100四種大孔樹脂純化效果,優選最佳大孔樹脂純化后的百合多糖進行藥理實驗。以小鼠回腸組織分泌性免疫球蛋白A(SIgA)的含量、血液內毒素(LPS)含量、血清炎癥因子白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量、菌群數量為評價指標,首次研究純化后的百合多糖對腸道菌群失調小鼠調節作用,為百合多糖調節胃腸道微生態菌群作用機制的研究百合多糖微生態調節劑的臨床使用和進一步開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百合 粉碎過40目篩,留實驗室備用,哈藥集團世一堂有限責任公司(批號:17080195);三蒸水 佳木斯大學天然藥物化學實驗室;95%乙醇、苯酚、濃硫酸 分析純,天津市瑞金特化學品有限公司;AB-8、D315、D101、HPD-100大孔樹脂 上海源葉生物科技有限公司;酶聯免疫試劑盒SIgA、LPS、IL-6及TNF-α誠吾康肽生物有限公司;清潔級昆明種小鼠 雄性,18～22 g,60只,遼寧長生生物技術股份有限公司(SCXK(遼)2015-0001);鹽酸林可霉素 河南天方藥業股份有限公司;麗珠腸樂 珠海麗珠集團麗珠制藥廠;乳桿菌選擇性培養基(LBS瓊脂)、BBL瓊脂培養基基礎、伊紅美藍瓊脂(EMB)、腸球菌瓊脂 青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

KQ-250DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TGL-16M臺式高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司;RE-2000A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;FA2004型電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;DL-5-B低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;粉碎機 上海儀電科學儀器股份有限公司;765型紫外-可見分光光度計 上海儀電第三分析儀器廠;Sunrise吸光酶標儀 瑞士帝肯公司;HITACH7800透射電鏡 日本日立有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 百合多糖提取 參照張占軍等[20]的方法并加以改進,采用超聲輔助提取百合多糖,稱取百合粉100 g,百合粉與三蒸水比為1∶10 g/mL置于2000 mL燒杯,在溫度70 ℃、超聲功率120 W條件下,于超聲波清洗器中提取40 min,提取液經8層紗布過濾,3500 r/min、25 ℃離心10 min,取上清液,55 ℃下減壓濃縮為原體積的1/5后,加入3倍體積的無水乙醇醇沉至上清液濃度達到85%,4 ℃放置24 h,3500 r/min、25 ℃離心15 min,取沉淀,50 ℃真空干燥得百合粗多糖。按上述操作多次提取百合粉共5 kg[18]。

1.2.2 百合多糖純化

1.2.2.1 除蛋白 將1.2.1得到的百合粗多糖配制成5%的多糖溶液,將5%的三氯乙酸與多糖溶液1∶1混合,振搖20 min,4 ℃下放置12 h,3500 r/min、25 ℃離心15 min取上清液,用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調至pH=7,溶液55 ℃下減壓發濃縮為原體積的1/10,凍干得除去蛋白后的百合多糖[19]。

1.2.2.2 大孔樹脂純化 參照廖琴等[18]的方法并加以改進,將1.2.2.1得到的百合多糖配成濃度為5 mg/mL的多糖溶液,分別稱取50 g AB-8、D315、D101、HPD-100 4種已處理好的樹脂對百合粗多糖溶液進行吸附實驗,調節色譜柱流速為3.5 mL/min,25 ℃下收集流出液,55 ℃下減壓濃縮為原體積的1/10凍干得純化后的百合多糖[20]。

1.2.3 百合多糖含量、脫色率及純化產率測定

1.2.3.1 葡萄糖標準曲線繪制 參照朱泉[21]的方法,于波長490 nm處測定吸光度,縱坐標y代表吸光度,橫坐標x代表葡萄糖濃度(mg/mL)繪制標準曲線。

1.2.3.2 百合多糖含量測定 配制百合粗多糖及純化后的百合多糖溶液,濃度為0.1 mg/mL,按上述方法測得吸光度,測量3次,代入線性回歸方程計算多糖濃度x(mg/mL),并計算百合粗多糖及純化后百合多糖的糖含量,計算公式如下:

1.2.3.3 百合多糖脫色率及純化產率測定 分別按1.2.3.2測定百合粗多糖及純化后多糖的吸光度,得脫色率,并計算其純化產率,計算公式如下:

式中:A0:脫色前吸光度;A1:脫色后吸光度。

式中:m0:純化前百合多糖質量(mg);m1:純化后百合多糖質量(mg)。

1.2.4 腸道微生態調節作用研究

1.2.4.1 給藥劑量及實驗方案 將60只昆明雄性小鼠適應性飼養7 d,隨機分為空白組、模型組、陽性組、百合多糖低、中、高6組,每組10只。空白組每天按10 mL/kg灌胃生理鹽水,共21 d;模型組第1、2、3 d按10 mL/kg灌胃鹽酸林可霉素,此后每天按10 mL/kg灌胃生理鹽水,共21 d;陽性組第1、2、3 d按10 mL/kg灌胃鹽酸林可霉素,此后每天按20 mg/kg灌胃麗珠腸樂,共21 d;多糖用藥組(低、中、高劑量組)第1、2、3 d按10 mL/kg灌胃鹽酸林可霉素(鹽酸林可霉素:64 μL鹽酸林可霉素用生理鹽水稀釋至1 mL),此后每天按50、100、200 mg/kg灌胃經D315大孔樹脂純化后的百合多糖,共21 d。

1.2.4.2 體重的測定 每3 d稱1次體重、共10次(包括適應性飼養7 d,共28 d)。

1.2.4.3 腸粘膜病理標本觀察 實驗結束后,取回腸末端組織,切成1 mm×1 mm的小塊,采用2.5%戊二醛固定,鋨酸后固定,丙酮脫水,樹脂包埋,超薄切片,鋁鈾染色,使用透射電鏡觀察。

1.2.4.4 LPS、IL6及TNF-α的含量測定 實驗結束后,眼球取血,將上述各組小鼠的靜脈血放置15 min,使用高速冷凍離心機在4 ℃下進行冷凍離心(5000 r/min,15 min)收集血清。用酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測血清LPS、IL6、TNF-α的含量。

1.2.4.5 回腸組織SIgA的含量測定 無菌取小鼠回腸按1∶9的比例進行組織勻漿,在4 ℃下進行冷凍離心(5000 r/min,15 min),取上清液,回腸上清液用酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測SIgA的含量。

1.2.4.6 造模后、給藥后小鼠糞便菌群數量檢測 參照羅蘭等[22]的方法加以改進,糞便逼迫法取造模后(灌胃鹽酸林可霉素3 d后)的小鼠新鮮糞便及連續給藥21 d后小鼠糞便0.1 g于去離子水處理過的離心管中,使用生理鹽水稀釋10-5,均勻涂布于雙歧桿菌(BBL)、乳酸桿菌(LBS)、大腸桿菌(EMB)、腸球菌(EC)選擇培養基中各5 μL,BBL和LBS厭氧培養72 h,EMB和EC需氧培養24 h,結果取對數,菌落計數[22]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 百合多糖脫色率及純化產率測定

由圖1可知經AB-8、D315、D101、HPD-100大孔樹脂純化的多糖脫色率分別為29.12%±1.13%、35.11%±1.12%、30.26%±1.48%、27.22%±1.79%;純化產率分別為25.23%±1.13%、40.82%±1.28%、40.23%±1.46%、30.22%±1.33%,其中經D315大孔樹脂優化后的百合多糖脫色效果最佳,純化產率最高。

圖1 純化產率及脫色率值

2.2 百合多糖糖含量測定

由圖2可知線性回歸方程為:y=7.007x+0.096,決定系數R2=0.9992,百合粗多糖糖含量為52.22%±2.21%,經AB-8、D315、D101、HPD-100大孔樹脂優化后的百合多糖糖含量分別為60.25%±3.26%、82.56%±1.18%、65.63%±2.63%、59.44%±2.55%,其中經D315大孔樹脂純化后的百合多糖糖含量提高最多。

圖2 葡萄糖標準曲線

2.3 腸道微生態調節作用研究

2.3.1 小鼠體重變化 小鼠體重變化(28 d)如圖3所示,實驗過程中無小鼠死亡,6組小鼠與初始相比體重均有增長。空白組小鼠體重穩步增長,模型組、陽性組、多糖低、中、高劑量組灌胃鹽酸林可霉素3 d后(7～10 d)小鼠體重出現下降,給藥后(11～28 d)陽性組、多糖低、中、高劑量組小鼠體重穩步增長。

圖3 小鼠體重變化

2.3.2 腸粘膜病理標本觀察 透射電鏡結果如圖4所示,與空白組相比,模型組小鼠腸粘膜微絨毛排列疏松、長短不一,可能是由于鹽酸林可霉素造成小鼠腸黏膜屏障功能衰竭,導致腸絨毛損傷脫落;與模型組相比,陽性組小鼠腸粘膜微絨毛排列整齊,基本恢復正常狀態,多糖低劑量組小鼠腸粘膜絨毛雖偶有疏松,但較模型組比狀態有所恢復,多糖中、高劑量組小鼠腸粘膜絨毛排列整齊、無斷裂,基本恢復與空白組狀態一致,其中百合多糖高劑量組效果最佳。分析結果為百合多糖可改善腸絨毛形態結構,緩解腸黏膜屏障功能衰竭,減少腸絨毛損傷脫落,使其恢復規則的排列,且隨著給藥濃度增加,治療效果越明顯[23]。

圖4 腸粘膜病理標本透射電鏡結果(8000×)

2.3.3 LPS、IL-6及TNF-α的含量測定

2.3.3.1 LPS含量測定 小鼠LPS含量如表1所示,與空白組相比,模型組小鼠LPS含量極顯著增加(P<0.01),可能是由于腸道菌群失調使LPS快速釋放導致其含量增加;與模型組相比,低劑量組小鼠LPS含量顯著降低(P<0.05),陽性組、多糖中、高劑量組極顯著降低(P<0.01),可能是由于百合多糖可改善腸道菌群紊亂,調節腸道菌群失調小鼠并扶植有益菌的數量,抑制有害菌的數量從而降低LPS的含量。結果表明百合多糖可以恢復腸道菌群失調小鼠LPS的含量,且高劑量組效果最佳[24]。

表1 小鼠LPS的含量(n=10)

2.3.3.2 IL-6含量測定 小鼠IL-6含量如表2所示,與空白組相比,模型組小鼠IL-6的含量極顯著升高(P<0.01),可能是由于腸道菌群失調導致促炎因子IL-6含量增加;與模型組相比,低劑量組小鼠IL-6的含量顯著降低(P<0.05),陽性組、多糖中、高劑量組極顯著降低(P<0.01),可能是由于百合多糖可改善腸道菌群紊亂,調節腸道菌群從而改善炎癥因子IL-6的含量。結果表明百合多糖可以恢復腸道菌群失調小鼠的IL-6的含量,且高劑量組效果最佳[25]。

表2 小鼠IL-6的含量(n=10)

2.3.3.3 TNF-α含量測定 小鼠TNF-α含量如表3所示,與空白組相比,模型組小鼠TNF-α含量極顯著增加(P<0.01),可能是由于腸道菌群失調導致促炎因子TNF-α含量增加;與模型組相比,低劑量小鼠顯著降低(P<0.05),陽性組、中、高劑量組極顯著降低(P<0.01),可能是由于百合多糖抑制TNF-α蛋白的合成和分泌,下調其轉錄水平,從源頭上抑制小鼠炎癥反應。結果表明百合多糖可以恢復腸道菌群失調小鼠TNF-α的含量,且高劑量組效果最佳[26]。

表3 小鼠TNF-α含量(n=10)

2.3.4 SIgA的含量測定 小鼠回腸組織SIgA含量如表4所示,與空白組比較,模型組小鼠回腸組織SIgA極顯著降低(P<0.01),可能是由于腸道菌群失調,炎癥因子含量增加導致SIgA含量降低,以上結果表明造模成功;與模型組相比,低、中劑量組顯著增高(P<0.05);陽性組、高劑量組極顯著升高(P<0.01),可能是由于百合多糖通過腸道吸收過程,作用于腸道黏膜,增強腸道黏膜免疫功能從而改善SIgA的含量。結果表明百合多糖可以恢復腸道菌群失調小鼠SIgA的含量,且高劑量組的效果最佳[26]。

表4 小鼠回腸組織SIgA含量(n=10)

2.3.5 造模后、給藥后小鼠糞便菌群數量檢測

2.3.5.1 造模后小鼠糞便菌群數量檢測 造模后小鼠糞便菌群數量如表5所示,與空白組相比,造模后模型組、陽性組、多糖低、中、高劑量組的小鼠有益菌均顯著降低(P<0.05),有害菌均顯著升高(P<0.05),可能是由于腸道菌群失調時,益生菌會大量減少,有害菌會大量增殖,破壞腸道環境所致,以上結果表明本次實驗造模成功[27]。

表5 造模后小鼠糞便菌群數量檢測(lg CFU/g,n=10)

2.3.5.2 給藥后小鼠糞便菌群數量檢測 給藥后小鼠糞便菌群數量如表6所示,與空白組相比,模型組小鼠雙歧桿菌、乳酸桿菌數量均顯著降低(P<0.05),腸球菌、腸桿菌數量均顯著增加(P<0.05),表明造模成功;與模型組相比,給藥后的陽性組、多糖低、中、高劑量組小鼠腸球菌、腸桿菌數量均顯著降低(P<0.05),雙歧桿菌、乳酸桿菌數量均顯著增加(P<0.05)。這可能是由于腸道內有益菌利用多糖進行代謝后產生了乳酸、乙酸等短鏈脂肪酸,降低了腸道內的pH,從而抑制腸球菌、大腸桿菌的生長[27]。結果表明百合多糖能夠在一定程度上調節因鹽酸林可霉素導致的腸道菌群失調,且高劑量組效果最佳。

表6 用藥后小鼠糞便菌群數量檢測(lg CFU/g,n=10)

3 討論與結論

LPS脂多糖是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分,對宿主是有毒性的。革蘭氏陰性細菌在快速生長階段及裂解死亡時均會釋放LPS,其中高達60%的LPS是由于細菌的快速生長釋放的。因此腸道菌群失調所致腸道內有害菌增加、有益菌減少導致細菌快速增長釋放LPS。百合多糖治療菌群失調引起的腸炎過程中有多種免疫因子共同參與。TNF-α可以促進T細胞產生各種炎癥因子如白細胞介素-2(IL-2)、IL-6等引起炎癥反應,其中IL-6能誘導B細胞分化和產生抗體,并誘導T細胞活化增殖、分化,參與機體的免疫應答,是炎性反應的促發劑。以SIgA為主的體液免疫在腸黏膜系統中起主導作用,它是防御病菌在腸道黏膜粘附和定值的第一道防線,對各種內源共生菌及外源入侵的病原體都有抵抗作用[28-30]。

因此本文以小鼠回腸組織SIgA的含量、LPS含量、血清炎癥因子IL-6、TNF-α的含量、菌群數量為評價指標,研究純化后的百合多糖對腸道菌群失調小鼠調節作用。實驗結果表明,D315大孔樹脂純化百合多糖效果最佳,純化產率、脫色率及多糖含量分別為:40.82%±1.28%、35.11%±1.12%、82.56%±1.18%。藥理實驗結果表明,造模后小鼠有益菌顯著降低(P<0.05),有害菌顯著增加(P<0.05);與模型組相比,百合多糖低劑量組小鼠血漿LPS含量、血清炎癥因子IL-6、TNF-α的含量顯著降低(P<0.05),多糖中、高劑量組含量極顯著降低(P<0.01),百合多糖低、中劑量組顯著提高回腸組織SIgA含量(P<0.05),高劑量組小鼠含量極顯著增加(P<0.01),百合多糖低、中、高劑量組腸桿菌、腸球菌的數量顯著降低(P<0.05),乳酸桿菌、雙歧桿菌的數量顯著增加(P<0.05);腸粘膜病理標本表明,多糖低劑量組小鼠腸粘膜絨毛雖偶有疏松,但較模型組比狀態有所恢復,多糖中、高劑量組小鼠腸粘膜絨毛排列整齊、無斷裂,基本恢復與空白組狀態一致。

張宇等研究黃芪多糖對微生態的調節作用,結果表明黃芪多糖可降低腸道菌群失調小鼠LPS的含量[24]。馮瀾用馬齒莧多糖治療結腸炎小鼠,發現小鼠盲腸中雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌明顯增多,腸桿菌、腸球菌等有害菌明顯下降,同時小鼠體內抗炎細胞因子IL-10的水平提高,促炎細胞因子TNF-α、IL-6水平降低[25]。李東琦等[26]研究玉屏風多糖對腸道菌群失調小鼠免疫功能影響,其中中、高劑量組小腸SIgA的含量均顯著高于自然恢復組(P<0.05)。王琳等[27]研究了五味子多糖對小鼠腸道菌群的影響,結果表明五味子多糖對因腸道菌群失調所致有害菌增多有益菌減少的情況有所改善,表明五味子多糖對小鼠腸道菌群紊亂有調節作用。這與本文研究結果相一致。

結果表明百合多糖可能是通過抑制LPS、IL-6、TNF-α含量的增加,進而抑制細胞內炎癥因子的釋放,提高SIgA的含量并通過扶植腸道內有益菌、抑制有害菌的含量調節腸道菌群失調。本文為百合多糖調節胃腸道微生態菌群作用機制的研究百合多糖微生態調節劑的臨床使用和進一步開發奠定基礎。