桑白皮提取物對破骨細胞和成骨細胞活性的影響

郭東貴,俸婷婷,張 敏,王慧娟,*

(1.貴州理工學院食品藥品制造工程學院,貴州貴陽 550003;2.貴州中醫藥大學藥學院,貴州貴陽 550025;3.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025)

骨質疏松癥是基于骨重建過程中成骨細胞與破骨細胞的協作和平衡被打破,使骨吸收大于骨形成,從而引發骨質疏松的一種骨代謝性疾病[1-2]。基于現代醫藥研究的發展,從細胞水平上研究成骨細胞與破骨細胞的平衡與協作,探尋抑制破骨細胞吸收和/或促進成骨細胞形成的活性物質,成為開發抗骨質疏松藥物和功能性食品的重要途徑。

保健類食品在預防和治療骨質疏松癥的過程中發揮著重要作用,因其具有毒副作用小、價廉等優點,近年來受到人們越來越多的研究和關注[3-5],并且,利用中醫保健理論,將民族藥開發成保健食品用于預防骨質疏松癥的研究也逐步深入[6-7]。桑白皮為桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥根皮,性甘寒,歸肺經,具有瀉肺平喘、利水消腫之功效[8]。現代藥理研究表明,桑白皮還具有降糖、降脂、抗炎等作用[9-11]。在中醫臨床與研究中,桑白皮常與其他藥材組成復方制劑,用于防治肥胖及糖尿病等引起的骨質疏松[12-14],表明其具有抗骨質疏松的潛力。但目前未見桑白皮單獨用于抗骨質疏松方面的研究報道。

本文采用體外細胞模型,研究桑白皮不同提取物對成骨細胞增殖及破骨細胞形成的影響,旨在探討桑白皮抗骨質疏松的活性作用,為其保健功能的研究及應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細胞株MC3T3-E1 Subclone 14(小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14) 中國科學院上海細胞庫;桑白皮藥材 貴州省藥材公司;摩魯新L對照品 實驗室自制(經1H-NMR、13C-NMR、MS和HPLC檢查,均為單一組分。HPLC歸一化法測定,純度為99.6%);α-MEM液體培養基 HyClone公司;α-MEM干粉培養基 Gibico公司;二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT) 北京Solarbio公司;胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司;抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒、1α,25-(OH)2VitD3美國Sigma公司;青鏈霉素混合液 北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

LEICA DMi8型倒置熒光相差顯微鏡 徠卡;SW-CJ-1FD型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;VARIOSKAN LUX型酶標儀、EVOLUTION 201型紫外-可見分光光度計、LOCATOR JR PLUS型液氮罐、3111型CO2培養箱 Thermo Scientific;YXQ-LS-50SSII型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司;BP201S型電子天平 賽多利斯有限公司;LGJ-12型冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑白皮提取物的制備

1.2.1.1 桑白皮水提物 將桑白皮藥材粉碎,稱取100 g,按照前期實驗優化的料液比(1∶10 g/mL)加入蒸餾水,加熱至微沸,回流提取3次,合并提取液,過濾,濃縮干燥,即得水提物W。

1.2.1.2 桑白皮醇提物 稱取100 g桑白皮粉末,按照前期實驗優化的料液比(1∶40 g/mL)加入70%乙醇,65 ℃回流提取3次,合并提取液,過濾,濃縮干燥,即得醇提物E。

1.2.1.3 桑白皮純化提取物R 按“1.2.1.2”項下方法制備桑白皮醇提液,過濾,濃縮后通過AB-8大孔樹脂進一步純化,收集70%乙醇洗脫液[15],濃縮干燥,即得提取物R。

1.2.1.4 桑白皮純化提取物PA 將“1.2.1.3”項下經AB-8大孔樹脂純化后的產物,再經聚酰胺柱層析進行分離純化,收集50%乙醇洗脫液[15],濃縮干燥,即得提取物PA。

1.2.2 桑白皮提取物中總黃酮的含量測定

1.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取摩魯新L對照品20.3 mg,加乙醇制成每1 mL含摩魯新L 81.2 μg的對照品溶液。

1.2.2.2 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,分別置10 mL量瓶中,各加3% AlCl3溶液0.5 mL,再加乙醇至刻度,搖勻,放置30 min,以不加顯色劑的樣品溶液為空白,在410 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線,計算回歸方程。

1.2.2.3 樣品測定 取桑白皮提取物適量(W和E各0.05 g,R和PA各0.02 g),精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入乙醇50 mL,稱定重量,加熱回流2 h,放冷,再稱定重量,用乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,照“1.2.2.2”項下方法,自“加3% AlCl3溶液0.5 mL”起,依法測定吸光度,同時精密量取供試品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,加乙醇至刻度,搖勻,作為空白溶液。通過標準曲線求出供試品溶液中摩魯新L的含量,并計算樣品中總黃酮的含量(以摩魯新L計)。

1.2.3 實驗分組 空白對照組:培養孔中接種與實驗組等量的細胞,加入含1‰ DMSO的培養基進行培養。

調零組:培養孔中不接種細胞,只加入含1‰ DMSO的培養基。

實驗組:各提取物均設置3個劑量組。W和E:5、10、20 mg/L;R和PA:10、20、50 mg/L。

1.2.4 桑白皮提取物對破骨細胞形成的影響 從出生48 h以內乳兔后肢的股骨和脛骨中獲取骨髓細胞懸液,過200目細胞篩,計數后將細胞懸液濃度調整至2×106個/mL,接種于24孔板中培養,每孔500 μL。24 h后吸棄孔內培養液,PBS輕洗1次,然后加入桑白皮提取物W、E、R、PA或空白破骨誘導培養基(α-MEM全培養基中加入10-8mol/L 1α,25-(OH)2VitD3)繼續培養,以后每隔2 d換一次液。培養8 d后棄培養液,PBS輕洗后進行TRAP染色,具體染色方法參照抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒中所附說明書。染色后置于顯微鏡下觀察,統計各培養孔內的TRAP陽性細胞個數。

1.2.5 桑白皮提取物對成骨細胞活性的影響 將成骨細胞MC3T3-E1 Subclone 14消化,制成單細胞懸液,計數后將細胞懸液濃度調整至5×104cell/mL,接種于96孔培養板中,每孔100 μL。培養24 h后吸棄各孔培養液,更換為新配制的含藥α-MEM全培養基或空白α-MEM全培養基(含10% FBS和1%的青-鏈霉素),置培養箱內繼續培養48 h,每孔加入10 μL 5.0 mg/mL MTT溶液,4 h后吸棄孔內液體,每孔加入150 μL DMSO,振蕩10 min充分溶解結晶物,于490 nm下測定吸光度值,并計算增殖率。

1.3 數據處理

實驗數據以表示,采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法,P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制備

結果如圖1所示,對照品溶液在8.12～48.72 μg/mL范圍內呈良好線性關系:y=0.011x+0.0071(R2=0.9991)。

圖1 標準曲線圖

2.2 桑白皮提取物中總黃酮的含量

如表1所示,桑白皮醇提物E中總黃酮的含量要高于水提物W。醇提物E經AB-8大孔樹脂富集后黃酮含量有所提高,再經聚酰胺柱層析進一步純化,總黃酮含量可達37.23%。

表1 桑白皮提取物中總黃酮的含量測定結果(n=3)

2.3 桑白皮提取物對破骨細胞的活性作用

破骨細胞作為骨結構中的重要細胞,是一類末端分化的多核細胞,不能增殖傳代[16-17]。骨髓細胞經誘導后可分化成破骨細胞,TRAP酶是破骨細胞的特異性標志酶,通過TRAP染色陽性計數,可以反映出破骨細胞的數量[18]。通過研究桑白皮提取物對破骨細胞形成的影響,可提示其抗骨質疏松的活性。

由前期初篩實驗結果可知,當提取物W和E劑量達50 mg/L、R和PA劑量達100 mg/L時,培養孔中出現空曠區域,說明藥物濃度較高時對骨髓細胞有一定毒性,因此降低劑量進一步研究,結果見表2～表5和圖2。

圖2 各組破骨細胞的TRAP染色圖片(×50)

表2 水提物W對TRAP陽性破骨細胞個數的影響(n=5)

表3 醇提物E對TRAP陽性破骨細胞個數的影響(n=5)

表4 提取物R對TRAP陽性破骨細胞個數的影響(n=5)

表5 提取物PA對TRAP陽性破骨細胞個數的影響(n=5)

由圖2可知,各空白對照組破骨細胞數量較多,且破骨細胞體積較大。與空白組相比,桑白皮各提取物高劑量組的TRAP陽性細胞個數顯著減少(P<0.01),且破骨細胞體積相對較小。由表2～表5的結果可知,水提物W(20 mg/L)、醇提物E(10、20 mg/L)、純化提取物R(20、50 mg/L)和純化提取物PA(10、20、50 mg/L)均能顯著或極顯著抑制破骨細胞形成(P<0.05或P<0.01)。對于桑白皮粗提物來說,醇提物E抑制破骨細胞作用強于水提物W,而醇提物E的黃酮含量高于水提物W,表明桑白皮粗提物對破骨細胞的活性作用與黃酮含量有關,隨黃酮含量增加而增強。桑白皮醇提物進一步純化后,純化提取物PA抑制破骨細胞作用明顯強于純化提取物R,活性作用也隨黃酮含量增加而增強。

2.4 桑白皮提取物對MC3T3-E1 Subclone 14細胞的活性作用

MC3T3-E1 Subclone 14是從小鼠顱頂骨中分離培養而來的成骨前體細胞,是體外研究成骨細胞常用的細胞模型。本文通過MTT法考察桑白皮提取物對MC3T3-E1 Subclone 14細胞活性的影響,測定結果見表6～表9。

表6 水提物W對MC3T3-E1 Subclone 14細胞增殖的影響

表7 醇提物E對MC3T3-E1 Subclone 14細胞增殖的影響

表8 提取物R對MC3T3-E1 Subclone 14細胞增殖的影響

表9 提取物PA對MC3T3-E1 Subclone 14細胞增殖的影響

研究表明,四種提取物的各劑量組均能促進MC3T3-E1 Subclone 14細胞的增殖,與空白組相比,均具有統計學意義(P<0.01)。其中,醇提物E各劑量組增殖率均稍大于同劑量組的水提物W,而純化提取物R和PA的增殖率又明顯大于醇提物E,說明桑白皮醇提物經進一步純化后對MC3T3-E1 Subclone 14細胞的促增殖作用有所增強。結合“2.2”項下各提取物的黃酮含量測定結果(PA>R>E>W),表明桑白皮不同提取物對成骨細胞的促增殖作用與其黃酮含量有關,活性作用隨黃酮含量增加而增強。

3 討論與結論

破骨細胞和成骨細胞是骨重構過程中的重要組成部分,二者處于生理平衡狀態,這種平衡一旦被打破就會引起骨質疏松等骨代謝性疾病[19]。以破骨細胞和成骨細胞作為體外活性篩選模型,是開發抗骨質疏松藥物和保健食品的重要途徑。

黃酮類物質作為功能性食品的重要活性成分,廣泛存在于藥用和食用植物中[20]。并且,許多黃酮類物質顯示出了較好的骨保護性能和抗骨質疏松特性[21-22]。研究表明,類風濕關節炎、氧化應激、雌激素缺乏都能引起骨質疏松的發生[23-25],而天然黃酮類物質具有抗炎、抗氧化和植物雌激素樣作用[26-27],因此黃酮類物質的抗骨質疏松特性與其自身的生物活性密切相關。

本文利用1α,25-(OH)2VitD3誘導兔骨髓細胞建立的破骨細胞實驗模型和MC3T3-E1 Subclone 14成骨細胞實驗模型,研究桑白皮不同提取物的體外活性作用。研究表明,桑白皮提取物在一定劑量下能夠抑制破骨細胞的形成,且對成骨細胞的增殖具有促進作用,表明桑白皮具有調節破骨細胞和成骨細胞平衡協作的潛力。桑白皮中黃酮類化合物含量豐富[28],本文制備了桑白皮的不同提取物并對其黃酮含量進行了測定。結果發現,桑白皮提取物對破骨細胞和成骨細胞的活性作用與黃酮含量有關,隨黃酮含量增加而增強,推測黃酮類化合物可能是桑白皮發揮抗骨質疏松活性作用的重要成分,但其作用機制還有待進一步研究和評價。