應用離子液體溶劑體系提取天然蝦青素的研究進展

張莉莉,李婉菁,彭錦學,高 靜

(廣東海洋大學食品科技學院，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東湛江 524088)

蝦青素(3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素),又名蝦黃素,結構類似于β-胡蘿卜素。

如圖1所示,蝦青素的分子結構中每個紫羅酮環上都有羥基和酮基,使其具有突出的抗氧化特性[1]。位于分子結構中心的共軛雙鍵使蝦青素外觀呈現紅色,該共軛雙鍵貢獻電子與生物體內的自由基反應轉變成更穩定的產物,能夠在生物體中通過多種方式終止自由基鏈式反應而達到抗氧化目的[2]。與葉黃素、維生素C、β-胡蘿卜素等相比,共軛雙鍵、羥基和酮基的存在使蝦青素兼具親水性和疏水性,能夠穿越細胞膜的疏水性內部到達親水性外部空間,而具有更優良的生物活性[3]。例如,蝦青素分子結構中的多烯鏈誘導自由基進入細胞膜,其末端環在細胞膜外部以及內側將其清除。蝦青素的抗氧化活性被證明是玉米黃質、葉黃素、角黃素和β-胡蘿卜素的10倍,是α-維生素E的100倍。另外,蝦青素通過在細胞膜內部猝滅單個氧分子、清除自由基進而起到抗脂質氧化、提高免疫系統功能和基因表達秩序的作用[4-5]。不僅如此,蝦青素還具有顯著的抗炎性、抗糖尿病、心血管疾病預防、免疫調節及抗癌變等功能[6-9]。近年來,研究發現蝦青素還具有改善高脂所致肝代謝紊亂的節律性調節和降血糖的作用[10-11]。蝦青素優越的生物活性和突出的生理功能使其具有極高的經濟價值。

圖1 游離蝦青素及蝦青素酯的化學結構

值得注意的是,市場中90%以上的蝦青素通過化學合成獲得,人類日益提高的食品安全意識、各國對化學合成蝦青素安全性的嚴格監管以及不斷更新的食品、藥品安全法規促使從生物資源中獲取天然蝦青素成為社會關注的焦點和科學研究的熱點。離子液體通常由不對稱的有機陽離子和有機或無機陰離子組成。多項研究表明離子液體已廣泛應用于藜蘆醇[12]、多酚化合物[13]、生物堿[14]等生物活性分子的提取。此外,離子液體也常參與輔助提取并聯合高效液相色譜法定量生物活性物質如人工蛹蟲草活性成分[15]、肌肉組織中的氟喹諾酮類抗生素[16]、姜黃揮發油[17]、痕量氯酚類物質[18]等。由于離子液體所具有的溶解能力強、熔點低、熱穩定性好等優點可作為甲醇、丙酮等有機溶劑的助劑應用于蝦青素的提取工藝[19]。

通過減少或取代造成環境負荷的溶劑參與度而建立更加綠色的蝦青素提取技術和理論是提取天然蝦青素及其應用研究亟待解決的基礎科學問題。本文綜述了天然蝦青素的生物來源和常用提取方法,重點闡述了離子液體溶劑體系從不同生物資源中提取蝦青素及其機理的研究進展,旨在為天然蝦青素的綠色提取工藝提供理論依據。

1 蝦青素的生物來源及常見提取方法

圖2列舉了天然蝦青素的幾種生物來源及其干基含量[6,20]。蝦青素以立體異構體、同分異構體、游離蝦青素和蝦青素酯4種形態廣泛存在于雨生紅球藻、法夫酵母和蝦殼等天然生物資源中。雨生紅球藻對蝦青素的累積發生在營養生長期內,且游動細胞能快速合成大量蝦青素。雨生紅球藻中的蝦青素在生長限制條件下以單酯和二酯的混合物形式積累于細胞中,占藻類干重的1%～5%。雨生紅球藻所具有的細胞壁結構保護套(TLS)、次級壁(SW)和第三壁(TW)對生理化學細胞破壞具有顯著的抵抗力,使得蝦青素的提取難度增大,而熱化學提取過程中過量的熱或化學應力,會誘導蝦青素異構體的去飽和/降解和原位結構變化,從而影響蝦青素的質量[21]。在蝦加工過程中,蝦頭、蝦殼、蝦尾占全蝦總質量的40%～60%,通常作為下腳料被廢棄。從蝦蟹殼廢棄物中提取蝦青素不僅利于減少環境污染,而且可提高蝦蟹加工中副產物的高值化利用。此外,法夫酵母具有培養周期短、生產速度快且蝦青素含量高的優點。法夫酵母菌株的發酵培育過程中加入前體物質檸檬酸鹽可以促進乙酰輔酶A 的產生,從而使蝦青素的含量提升[22]。Flores-Cotera等[23]研究發現檸檬酸鹽的加入顯著增加了色素濃度和含量,可使蝦青素提取量高達600 μg/g。副球菌中雖然也含有大量蝦青素,但因其產量有限制約了蝦青素的提取,目前研究相對較少。

圖2 天然蝦青素的生物來源及其含量

陳國榮等[24]采用通過強流電場分次與高壓結合提取雨生紅球藻中的蝦青素,將所得提取液經固液分離、減壓濃縮、醇沉和干燥處理,最終獲得4.05%蝦青素產品。此外,鄭玉彬等[25]利用低溫亞臨界方法從雨生紅球藻中萃取獲得93.3%蝦青素,這種方法具有操作溫度低、有效成分活性保留好的優點。趙儀等[26]利用木瓜蛋白酶處理廢棄蝦殼,使蛋白質沉降同時分離蝦青素的方法比利用有機溶劑的釋放率提高了19.8%,總類胡蘿卜素提取量達到63.059 μg/g。Parjikolaeib等[27]研究使用向日葵油和向日葵油甲酯從蝦廢棄物中提取蝦青素,分別得到60%和80%的蝦青素。

表1列舉了目前提取蝦青素的常見方法。目前這些方法已經可以使蝦青素的提取率達到90%以上,但是仍然存在不同的問題。堿提法利用堿液脫蛋白原理分離蝦青素,缺點是堿耗量多且嚴重腐蝕設備。雖然有機溶劑具有較高的蝦青素溶解度,但存在試劑殘留、污染環境的風險。蝦青素也可以通過在植物油中溶解獲得萃取,油中的蝦青素可以提高脂質-蝦青素混合物的貯存穩定性,但油溫高、粘度大導致純化難度及分離成本增加,而且高溫不利于保持蝦青素的生物活性[28]。纖維素酶、果膠質酶等將細胞壁的組成成分水解或降解,從而利于蝦青素的提取。但是,酶用量高且耗時長[29]。超臨界萃取近年來也用于蝦青素提取但因投資成本較高而受限。超聲輔助、加壓液體、脈沖等非熱輔助萃取方法也快速發展起來[30]。近年來,離子液體在食品工業中的研究發展迅速[31-32]。

表1 常用的蝦青素提取方法

2 離子液體溶劑體系提取蝦青素及其機理

2.1 離子液體的種類

離子液體所具有的氫鍵、偶極-偶極、π-π、范德華力作用以及離子間相互作用(相互靜電吸引或帶電粒子的排斥)不僅可改善溶質與溶劑的相互作用,還具有破壞生物質組織結構的能力[39]。Elshaarawy等[40]利用水楊酸基離子液體成功從蝦殼中分離出生物高分子殼聚糖。2019年,Tolesa等[41]以銨基離子液體提取蝦殼中的甲殼素,同時發現經離子液體處理后,原來表面光滑、有序的蝦殼微結構發生畸變。Barber等[42]利用1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽([EMIM]OAc)離子液體與甲殼素分子間和分子內氫鍵組成的復雜網絡之間的相互作用,從蝦殼中提取甲殼素并通過靜電紡絲獲得甲殼素納米纖維材料。研究表明,咪唑基離子液體比吡啶基、銨基離子液體親水性強,應用最廣泛[37]。

表2列舉了目前常用于提取蝦青素的咪唑基離子液體陰、陽離子結構。陽離子烷基側鏈為乙基或丁基、陰離子為Br-或Cl-的咪唑基離子液體具有良好的極性[43]。Liu等[44]研究發現經離子液體預處理后,雨生紅球藻包囊細胞的蝦青素提取率呈現如下規律:[BMIM]Cl>[EMIM]Cl。Pinkert等[45]指出陽離子咪唑環上的異原子取代基中較長的側鏈附加極性比短側鏈更為明顯,而長側鏈的離子液體陰離子對細胞破壞更有效。

表2 提取蝦青素常見的離子液體

2.2 離子液體混合溶液從蝦殼中提取蝦青素

離子液體的陰離子與纖維素、甲殼素等聚合物形成強大的氫鍵網絡從而有效破壞聚合物的致密結構,展現出良好的溶解性[48-50]。高靜等[51]研究了蝦殼在離子液體[EMIM]OAc中的溶解行為,發現蝦殼在一定溫度下可以溶解在離子液體中。目前利用離子液體溶解蝦殼回收甲殼素的研究十分廣泛[52-53]。然而,由于大多數純離子液體在低溫下黏度大,不利于傳質,限制了對生物分子的提取。離子液體與其他試劑聯合形成室溫下低粘度的混合物體系提取蝦蟹殼中的蝦青素成為近年來的研究熱點。一般情況下,蝦類廢物中類胡蘿卜素的產量高于蟹類廢棄物[54]。蝦殼中色素細胞存在于底膜之下的結締組織中,放射狀或枝狀分枝的色素顆粒在色素細胞中聚集和擴散[45]。良好的蝦青素提取體系必須能夠穿透蝦殼中的結締組織進入色素細胞內部,而離子液體可以直接破壞蝦殼角質層,進入色素細胞內部。Bi等[19]使用了7種咪唑基離子液體/乙醇混合提取蝦殼中的蝦青素,發現胺基官能團與蝦青素有更好的相互作用且胺基的存在可保護蝦青素免受氧化。將0.5 mol/L[C3NH2MIM]Br與乙醇混合,在75 W超聲輔助下處理60 min,所得蝦青素含量較相同條件下的乙醇提取增加了98%。此外,Lee等[46]研究發現,加入0.25 mg/mL[EMIM]Br至丙酮中提取三疣梭子蟹廢料中的蝦青素,提取量由原來的5.47 μg/g增長至47.30 μg/g。

綜上,利用離子液體溶劑體系萃取蝦青素的研究均有有機溶劑的參與。然而,最新的兩項專利表明離子液體、乳化劑與水所配制的離子液體微乳液以及離子液體、鹽與水所構筑的雙水相體系均在從蝦殼中提取蝦青素的工藝中得到良好的應用,這說明具有操作簡便、條件溫和、提取時間短等特點的新方法正在逐步顯現,同時也表明離子液體與有機溶劑共同參與蝦青素提取工藝的這一趨勢正逐步轉變至避免有機溶劑的使用而減少其所帶來的環境負荷[55-56]。

2.3 離子液體預處理雨生紅球藻提高蝦青素的提取率

雨生紅球藻的成熟紅色囊腫細胞壁較厚,由一種強抗乙酰化的海藻三層鞘、纖維素和甘露糖均勻排列以及纖維素和甘露糖的非均勻排列組成,抗機械和化學作用能力強[57]。研究表明,咪唑基離子液體能改善雨生紅球藻包囊細胞的滲透性,增加離子液體濃度有利于細胞壁的分解,進而促使蝦青素溶出[44]。雨生紅球藻經離子液體處理后完整的囊腫細胞明顯撕裂、斷裂,釋放出細胞質,附著的紅色蝦青素清晰可見,隨后用正己烷萃取可獲得99%以上蝦青素提取率[21]。Teixeira等[57]提出了離子液體作用于細胞壁纖維素糖苷鍵水解的假定機理:(a)離子液體溶劑化使水分子離解成水合氫離子和氫氧根對;(b)氫氧根陰離子作為親核試劑作用于固定碳上,一個質子隨后供給裸氧中間體,糖基化甘露糖單元上的H-O-H和O-H-O氫鍵被破壞和溶劑化;(c)糖苷鍵被分解成兩個甘露聚糖片段。

為了減少預處理中離子液體的用量以及降低黏度,離子液體的水溶液逐漸替代了純離子液體。Desai等[58]觀察到用40% 1-乙基-3-甲基咪唑二磷酸二丁酯([EMIM]DBP)水溶液在45 ℃下處理干燥的微藻細胞90 min,隨即用乙酸乙酯進行溶劑萃取,蝦青素的提取率增加70%以上。Sun等[21]研究發現[EMIM]HSO4、[EMIM](CF3SO2)2N、[EMIM]CH3SO3三種離子液體水溶液比純離子液體或己烷萃取效果更好,并指出當離子液體在水溶液中的濃度范圍為6.7%～33.3%時,在30 ℃下處理2 h后蝦青素萃取率高達91.4%～99.0%。

2.4 離子液體的循環利用

離子液體的回收利用不僅減少環境負荷,而且彌補了其價格昂貴的缺陷,是擴大提取規模的必要條件。但是,目前在萃取體系中離子液體的重復使用還存在重要的技術問題。Zhou等[59]使用離子液體對微藻脂質進行提取,發現5次重復使用有較好的脂質提取率,同時發現反應體系中離子液體的損失及其離子液體含水量的增加是導致萃取率下降的主要原因。Pesai等[58]發現離子液體經三次重復使用后對雨生紅球藻的滲透效率明顯削弱。

3 結論與展望

無論采用離子液體作為溶劑直接提取蝦殼中的蝦青素還是預處理雨生紅球藻提高蝦青素提取率的研究都取得了顯著的成果,能夠為天然蝦青素的綠色提取工藝提供一定的理論依據。與有機溶劑相比,離子液體具有的良好溶解性以及可循環利用特性不僅獲得了高萃取量的蝦青素而且減少了環境負荷。

然而,雖然目前的研究已經朝著逐漸避免或替代有機溶劑的方向發展,但相關研究推動緩慢還需加快進程以降低蝦青素萃取過程中的安全風險。另一方面,相關提取研究關于作用機理的解釋尚有不足,需深入研究后進一步補充。