線狀納米金修飾碳纖維超微電極檢測蘆薈大黃素

楊莉莉，王婷婷，鮑昌昊，程 寒,*

(1.中南民族大學 藥學院，湖北 武漢 430074；2.中南民族大學 民族藥學國家級實驗教學示范中心， 湖北 武漢 430074)

蘆薈大黃素(AE)化學名為1，8-二羥基-3-羥甲基蒽醌，屬于蒽醌類化合物，為橙色針狀結晶或土黃色結晶粉末，是一種從蘆薈、大黃及決明子等中藥材中提取的生物活性成分[1-2]。AE因具有清除氧自由基和抗腫瘤活性[3]、抗炎和抗菌活性[4]、降血壓[5]和免疫抑制作用[6]等多種藥理活性，而引起了國內外學者的廣泛關注。目前已報道的AE檢測方法多為高效液相色譜法(HPLC)，如尚?；ǖ萚7]用HPLC法同時測定夏黃顆粒中蘆薈大黃素、大黃酸、厚樸酚、和厚樸酚、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚，饒楠楠等[8]用HPLC法檢測蘆薈中8種蒽醌類物質，潘家峰[9]比較了微乳液相色譜法(MELC)與常規HPLC法檢測大黃藥材中5種蒽醌類衍生物成分含量的效果，卻鮮有文獻報道用電化學方法檢測AE。而近年發展起來的電化學方法因具有靈敏度高、操作簡單、成本低廉等優點在很多領域得到了廣泛應用。

納米金粒徑小于100 nm，具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物大分子、小分子結合，性質穩定[10-13]。用檸檬酸三鈉還原氯金酸得到的納米金粒子表面帶負電荷，通過電沉積方法可以使納米金在碳纖維超微電極表面形成帶負電荷的膜，從而制得表面帶負電荷膜的修飾電極[14-15]。

本文采用化學還原法即檸檬酸三鈉還原氯金酸制備了線狀納米金顆粒，通過電沉積方法將納米金修飾至碳纖維超微電極(CFME)，通過優化電沉積時間，獲得穩定性和電催化性能良好的修飾電極。該修飾電極對體系帶正電荷的AE有顯著的電催化作用，從而構建了對AE電化學檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

XD-RFL實驗室倒置顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)；PTHW250ML型電熱套(武漢科爾儀器設備有限公司)；PHS-3C型pH計(上海儀器科學儀器股份有限公司)；Ag/AgCl電極為參比電極；CHI660D化學工作站(上海辰華儀器公司)；JEOL-JSM-6500F掃描電子顯微鏡(SEM，日本電子)。

碳纖維(直徑5 μm，吉林市神舟碳纖維有限責任公司)；氯金酸AuCl3·HCl·4H2O(純度≥47.8%,國藥集團化學試劑有限公司)；AE(純度≥97%，上海源葉生物科技有限公司)；檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O，分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；碳粉導電膠(自制)；實驗以pH 7.0的Tris-HCl緩沖溶液為底液，實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 線狀納米金及修飾電極的制備

在圓底燒瓶中加入50 mL 0.01%的氯金酸溶液，置于電熱套中邊攪拌邊加熱直至沸騰，然后加入0.16 mL 1.0%的檸檬酸三鈉溶液，在攪拌下持續加熱直至溶液顏色不再變化，此時溶液呈藍紫色。

將Ag/AgCl電極和已制好的CFME放入適量線狀納米金溶膠中,在+1.5 V恒電位下進行電沉積，使線狀納米金沉積于CFME表面，即在CFME表面形成納米金修飾層，將電極取出后用水清洗，得修飾好的碳纖維超微電極，記為LGN/CFME。

1.3 電化學測定

電化學檢測采用雙電極體系：以LGN/CFME為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極。差分脈沖伏安法(DPV)實驗參數為：電位掃描范圍-0.3～0.3 V，振幅0.05 V，脈沖寬度0.05 s，脈沖時間0.2 s，靜止時間20 s。實驗過程均在室溫下進行。

2 結果與討論

2.1 LGN/CFME對AE的電催化氧化

考察了電極修飾前后對1.0×10-4mol/L AE的電催化效果。將CFME置于線狀納米金溶膠(圖1A)中，于+1.5 V下電沉積12 min制得LGN/CFME。由掃描電鏡圖可見，未修飾的CFME(圖1B)表面光滑平整，修飾后其(圖1C)表面被一層納米金包裹，電極直徑略有增加，比表面積增大，可加快電極表面電子轉移速率，從而提高對AE的檢測效果。分別采用CFME和LGN/CFME在1.0×10-4mol/L AE中進行循環伏安測定，實驗結果如圖1D所示，氧化峰和還原峰均負移，其中前者Epa=-452 mV，Epc=-437 mV，ΔEp=15 mV(曲線a)；后者Epa=-510 mV，Epc=-440 mV，ΔEp=70 mV(曲線b)，說明AE在LGN/CFME上的電化學反應可逆性增加，電子轉移速率增強，LGN對AE的氧化還原反應具有良好的催化作用。

2.2 修飾電極電沉積時間的優化

通過控制恒電位沉積的時間對線狀納米金的負載量進行控制，即在線狀納米金溶液中于+1.5 V下分別恒電位沉積0、3、6、9、12、15、18 min，檢測1.0×10-4mol/L AE。結果如圖2所示，修飾后的電極較未修飾電極的氧化峰電流均有明顯增幅，隨著電沉積時間的增加，修飾至電極表面的納米金量增加，氧化峰電流不斷增加。當電沉積時間達12 min時，峰電流增加幅度最大，此后，繼續延長電沉積時間，則氧化峰電流略有下降，增幅趨于平緩，可能是由于電沉積時間較長使得納米金在電極表面不斷聚集，從而導致電極表面的修飾層部分脫落，電極的電催化活性降低。進一步考察不同電鍍時間得到的修飾電極的氧化峰電流相對標準偏差，結果顯示，電鍍時間為12 min時，其相對標準偏差最小(0.42%)。綜上，電極電沉積12 min時，修飾電極的電催化性能及穩定性最佳，因此本實驗均采用12 min為最佳電沉積時間。

圖1 線狀納米金的透射電鏡圖(LGN,A) 、碳纖維超微電極(CFME，B) 及納米金修飾碳纖維超微電極

圖2 1.0×10-4 mol/L AE在不同電沉積時間下的DPV曲線Fig.2 DPV curves of 1.0×10-4 mol/L AE at different deposition times deposition time(a-g) :0，3，6，9，12，15，18 min

2.3 掃速與pH值對氧化峰電流的影響

采用循環伏安法研究了電位掃描速率(v)對1.0×10-4mol/L AE在LGN/CFME上電化學行為的影響(圖3)。結果表明，掃描速率在50～1 000 mV/s范圍內，AE的氧化峰電流(Ip，nA) 隨掃速增大而增大，且與掃速(v，mV/s)呈良好的線性關系，其線性方程為：Ip=0.794 2v+256.4，線性相關系數(r2)為0.989 2，表明AE在LGN/CFME上的氧化過程受擴散控制?？紤]到掃描速率過快會增大充電電流，從而導致基線噪音變大，因此本實驗均在100 mV/s下進行。

分別用不同pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的Tris-HCl配制1.0×10-4mol/L AE溶液。在100 mV/s掃描速率下，考察了溶液在不同pH值下的循環伏安曲線(圖4)及其氧化峰電流與pH值的線性關系。結果表明，在此pH值范圍內，AE的氧化峰電位Ep與pH值呈線性關系，其線性方程為Ep(mV)=564.8-26.82 pH,r2=0.955 4，說明AE的電極反應中有質子參與，且AE的氧化峰電位Ep隨pH值的增加而負移，說明AE的氧化是脫質子的過程，在高pH值下氧化過程更易發生。而pH 5.0時AE的氧化峰電流最大，這是因為AE在酸性溶液中被還原為蒽酚及其互變異構體蒽酮，在CFME上有較高的電化學活性[16]。因AE在酸性溶液中易被還原，本實驗均在pH 7.0下進行。

圖3 1.0×10-4 mol/L AE在不同掃速下的CV圖Fig.3 CV curves of 1.0×10-4 mol/L AE at different scan rates scan rate (a-g):10,20,50,100,200,500,1 000 mV/s

圖4 1.0×10-4 mol/L AE在不同pH值下的CV圖Fig.4 CV curves of 1.0×10-4 mol/L AE in different pH values pH value (a-e):5.0,6.0,7.0,8.0,9.0

圖5 不同濃度AE在LGN/CFME的差分脈沖圖Fig.5 DPV curves of different concentration AE on LGN/CFME AE concentration(a-g):0.02,0.08,0.1,0.2, 0.5,0.8,1.0(×10-4 mol/L)

2.4 工作曲線的測定

在最佳實驗條件下，檢測了不同濃度AE的DPV響應曲線(見圖5)。結果顯示，隨著AE濃度的增加，其氧化峰電流(Ip，nA)增強，且與AE濃度(C，μmol/L)在2.0×10-6～1.0×10-4mol/L范圍內呈良好的線性關系，其線性方程為Ip=0.318 1C+25.01，r2=0.965 3，檢出限(S/N=3)為6.19×10-7mol/L，說明此方法可用于AE的測定，且具有靈敏度高、線性范圍寬的優點。

2.5 干擾實驗

在優化實驗條件下，考察了一些常見物質對AE測定的影響。當AE濃度為1.0×10-4mol/L，在1.0×10-4mol/L的蘆薈多糖和蘆薈苷共存下，峰電流改變在±10%以內，且峰電位偏移不超過±0.05 V，表明該修飾電極對AE的檢測具有良好的抗干擾能力。

2.6 實際樣品的分析

采用該修飾電極對實際蘆薈汁樣品中的AE含量進行定量分析。采用10 mmol/L pH 7.0的Tris-HCl緩沖溶液將蘆薈汁液稀釋10倍，以標準加入法對AE進行檢測。加入AE的標準溶液濃度分別為5.00、10.00、15.00、20.00、30.00 μmol/L。結果測得加標回收率為95.5%～103%，相對標準偏差(RSD)均小于5.0%(見表1)，表明該修飾電極可實現蘆薈汁中AE的定量分析。

表1 蘆薈汁中AE含量的測定(n=5)Table 1 Determination results of AE in aloe juice(n=5)

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3 結 論

本文提出了一種AE的電化學檢測方法，通過檸檬酸三鈉還原氯金酸制備了線狀納米金，采用一步恒電位沉積的方法在CFME上沉積納米金，用循環伏安法和差分脈沖法考察了LGN/CFME對AE的電催化氧化性能。該修飾電極對AE有明顯的電催化作用，檢出限達6.19×10-7mol/L。該檢測方法簡便、靈敏度高，修飾電極的穩定性和重現性良好，易制備，可用于AE的定量檢測。