長鏈非編碼RNA NEAT1在銀屑病中的表達及其與疾病活動度和炎癥因子水平的關聯分析

金 曌， 李聰慧， 程 楊， 蘇 慧， 付 霆

銀屑病是一種多基因遺傳背景下自身免疫紊亂導致的炎性皮膚病，在中國其總患病率約為0.47%，男女患病率無差異[1-4]。由于銀屑病病程長、易復發及難以治愈等特點，患者的預后仍然不容樂觀。因此亟需尋找與銀屑病患病風險和疾病活動度有關的生物標記物來監測患者病情和改善患者的預后。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)核富集轉錄本1(nuclear enriched abundant transcript 1, NEAT1)在免疫性疾病系統性紅斑狼瘡患者單核細胞中過表達，且與疾病活動度、炎癥因子表達量呈正相關；在骨關節炎患者中，lncRNA NEAT1的過表達和滑膜細胞的增生、炎癥因子表達量上調有關[5-6]。這些研究表明，lncRNA NEAT1在炎癥性疾病發生和進展過程扮演著重要角色。銀屑病作為一種典型的炎癥性皮膚病，lncRNA NEAT1也可能參與其發生、發展過程。本研究旨在評估lncRNA NEAT1在銀屑病患者病變皮膚組織中的表達水平以及其與疾病嚴重程度和炎癥因子水平的關聯。

1 對象與方法

1.1對象 收集2016年7月—2018年6月筆者醫院就診的銀屑病患者204例，男性122例，女性82例，年齡(46.4±12.4)歲(34～58.8歲)，體質量指數(body mass index, BMI)為(23.6±4.1)kg/m2(19.5～27.7 kg/m2)，病程、受累體表面積(body surface area, BSA)和銀屑病皮損面積及嚴重度指數(psoriasis area and severity index, PASI) 中位數分別為10.0年(5.0～14.8)年、19.0%(16.0%～22.0%)和8.4(6.8～12.1)。納入標準：(1)按照《中國臨床皮膚病學》中銀屑病的臨床診斷標準診斷為銀屑病[7]；(2)年齡>18歲；(3)同意鉆取皮膚病變組織及附近非病變組織。排除標準：除銀屑病以外別的皮膚炎癥疾病，或伴隨其他系統性免疫疾病，如類風濕關節炎、紅斑狼瘡。所有銀屑病患者均位于進展期，其中尋常型181例、關節型12例、局限性膿皰型6例及紅皮型5例。共有186例(91.2%)，172例(84.3%)，140例(68.6%)和22例(10.8%)患者正在接受局部治療、光療、系統性非生物制劑治療和系統性生物制劑治療。本研究獲得筆者醫院倫理委員會批準，所有納入研究的患者均簽署知情同意書。

1.2數據收集 患者納入研究后，記錄患者的年齡、性別、BMI、病程、銀屑病受累BSA并評估PASI評分；此外，記錄患者正在使用的藥物類型以排除藥物對lncRNA NEAT1水平的影響。

1.3標本獲取及保存 患者納入研究后，鉆取3 mm深度銀屑病病變組織標本，并同時鉆取病變5 cm外的配對正常皮膚組織標本，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.4定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測 采用qPCR檢測病變組織及配對正常皮膚組織的lncRNA NEAT1表達量，并檢測病變組織標本的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)、IL-8、IL-17和IL-22 mRNA的表達量。qPCR具體操作如下：采用TRIzol (美國Invitrogen公司)提取組織總RNA后，采用PrimeScript RT reagent (日本Takara公司)進行RNA的逆轉錄，采用One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (日本Takara公司)進行qPCR定量檢測。以GAPDH作為內參，并采用2-△△Ct法計算目標基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 qPCR引物設計

lncRNA：長鏈非編碼RNA；NEAT1：核富集轉錄物1；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細胞介素.

2 結 果

2.1lncRNA NEAT1的表達量 lncRNA NEAT1的表達量在正常皮膚組織和病變皮膚組織中的中位值分別為1.442(0.667～2.324)和3.014(1.498～4.960)。與正常皮膚組織比較，lncRNA NEAT1表達量在病變組織中明顯偏高(P<0.001，圖1A)。用于鑒別銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織的ROC曲線下面積(area under curve, AUC)為0.747(95%CI：0.700～0.794)，以最佳切割點lncRNA NEAT1的表達量2.077為閾值時(最佳切割點定義為敏感度和特異度之和最大的點)，區別銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織的敏感度為66.7%，特異度為72.5%(圖1B)，表明lncRNA NEAT1的表達量可以很好地區分銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織。

2.2lncRNA NEAT1表達量與患者臨床特征的關聯 銀屑病患者病變皮膚組織lncRNA NEAT1表達量與PASI評分呈正相關(r=0.275,P<0.001,表2)。此外，病變皮膚組織lncRNA NEAT1的表達量與患者年齡、性別、BMI、病程、受累BSA和治療方式均無關(表2，3)。進一步分析不同銀屑病分型與長鏈非編碼RNA NEAT1的關系，發現長鏈非編碼RNA NEAT1與不同銀屑病分型無顯著差異(P=0.094，表4)。

2.3PASI評分的關聯因素分析 采用單元線性回歸分析PASI評分的關聯因素，結果顯示病變皮膚組織lncRNA NEAT1表達量(P=0.001)、年齡(P=0.014)、受累BSA(P<0.001)和局部治療(P=0.005)均與PASI評分呈正相關。進一步采用多元線性回歸模型分析PASI評分的關聯因素，結果顯示病變皮膚組織lncRNA NEAT1(P=0.014)、受累BSA(P<0.001)和局部治療(P=0.008)均與PASI呈獨立正相關。其他臨床病理特征和PASI評分的關聯詳見表5。

表2 病變皮膚組織lncRNA NEAT1表達量和患者臨床特征(連續變量)的關聯

Tab 2 Association between lncRNA NEAT1 relative expression in psoriatic lesions and clinical characteristics (continuous variable) of psoriatic patients

臨床特征(連續變量)lncRNA NEAT1表達量rP年齡0.072BMI0.058病程0.038受累BSA0.111PASI評分0.275<0.001

lncRNA：長鏈非編碼RNA；NEAT1：核富集轉錄物1；BMI：體質量指數；BSA：體表面積；PASI：銀屑病皮損面積及嚴重度指數.

2.4lncRNA NEAT1表達量與炎癥因子mRNA表達量的關聯 病變組織炎癥因子TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22 mRNA的表達量分別為2.223(1.417～2.985),1.736(1.086～2.521),2.529(1.504～3.750),2.397(1.610～3.417)和2.782(1.642～4.220)。銀屑病患者病變皮膚組織lncRNA NEAT1的表達量與TNF-α mRNA(r=0.342，P<0.001)、IL-6 mRNA(r=0.315，P<0.001)、IL-8 mRNA(r=0.174，P=0.013)、IL-17 mRNA(r=0.345，P<0.001)和IL-22 mRNA(r=0.146，P=0.037)表達量均呈正相關(表6)。

表3 病變皮膚組織lncRNA NEAT1表達量和患者臨床特征(分類變量)的關聯

Tab 3 Association of lncRNA NEAT1 relative expression in psoriatic lesions with clinical characteristics (classified variable) of psoriatic patients

臨床特征(分類變量)lncRNA NEAT1表達量性別 女3.470(2.029～5.630) 男2.658(1.185～4.763)局部治療 無2.727(1.517～4.724) 有3.068(1.482～4.969)光療 無3.678(1.652～5.942) 有2.942(1.302～4.889)系統性非生物制劑治療 無3.338(1.743～5.262) 有2.893(1.302～4.889)系統性生物制劑治療 無2.931(1.445～5.103) 有3.544(1.646～4.592)

3 討 論

lncRNA NEAT1是從染色體11q13.1轉錄而來的，它含有兩種單體形式，分別是NEATI-1(3.7 kb)和NEATI-2(23 kb)，且被認為是病毒誘導的非編碼RNA[8-12]。最近的研究表明，lncRNA NEAT1與多種免疫性和炎癥性疾病的生物學活動密切相關。研究發現，lncRNA NEAT1 在系統性紅斑狼瘡中通過調節絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的下游，促進Toll樣受體(TLR4)介導的炎癥反應過程[6]。另一研究發現，lncRNA NEAT1在骨關節炎中滑膜細胞增生過程中可以抑制miR-181c的表達，從而促進骨橋蛋白表達和滑膜細胞增生，骨橋蛋白再參與調節多種促炎因子(例如IL-6和IL-8)的表達[5]。此外，lncRNA NEAT1還被發現在動脈粥樣硬化中受低密度脂蛋白誘導，參與亞核結構paraspeckle的形成，繼而paraspeckle通過核因子(nuclear factor-κB，NF-κB)和 p38 信號通路，參與巨噬細胞主導的炎癥和脂質的攝取[13]。以上研究表明，lncRNA NEAT1間接或直接調控炎癥反應，從而促進了免疫性或炎癥性疾病的發生或進展過程。臨床研究發現，在骨關節炎患者退化的滑膜組織中，lncRNA NEAT1 被發現表達量上調[5]。此外，在系統性紅斑狼瘡患者血液單核細胞中lncRNA NEAT1也高表達，且與疾病活動度呈正相關[6]。鑒于銀屑病是以高度炎癥為特征的自身免疫性皮膚病，筆者假設lncRNA NEAT1也與銀屑病的發病機理和進展過程有關。因此，筆者比較了銀屑病患者病變皮膚組織和配對正常皮膚組織中lncRNA NEAT1的表達量，結果表明lncRNA NEAT1在銀屑病患者病變皮膚組織中的表達量明顯高于正常皮膚組織，且ROC曲線結果顯示lncRNA NEAT1高表達可以用來很好地區分銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織。關聯分析表明，lncRNA NEAT1表達量和銀屑病疾病活動度呈正相關，進一步的多元線性回歸分析表明病變皮膚組織lncRNA NEAT1表達量與疾病活動度呈獨立正相關。這些結果可能的原因是：(1)lncRNA NEAT1可能在真皮層自體免疫細胞中通過結合核內蛋白PSPC1、SFPQ或p54nrb組成paraspeckle結構，繼而paraspeckle通過多種炎癥通路(如MAPK、NF-κB)促進真皮層自體免疫細胞分泌多種炎癥因子(包括TNF-α，IL-6，IL-8 和IL-1β等)，導致炎癥反應增強，因而臨床表現為銀屑病的活動度更高；(2)lncRNA NEAT1可能直接參與調控炎癥反應相關通路，誘導炎癥反應增強，使銀屑病患者的疾病活動度升高[5-6,13-15]。

表4 不同銀屑病分型和病變組織lncRNA NEAT1相對表達量的關聯

lncRNA：長鏈非編碼RNA； NEAT1：核富集轉錄物1； BMI：體質量指數；BSA：體表面積.

表5 PASI評分的關聯因素(線性回歸分析)

Tab 5 Factors affecting PASI score by linear regression analysis

炎癥因子mRNA相對表達量lncRNA NEAT1相對表達量rPTNF-α mRNA0.342<0.001IL-6 mRNA0.315<0.001IL-8 mRNA0.1740.013IL-17 mRNA0.345<0.001IL-22 mRNA0.1460.037

PASI：銀屑病皮損面積及嚴重度指數； lncRNA：長鏈非編碼RNA； NEAT1：核富集轉錄物1；IL：白細胞介素;TNF-α：腫瘤壞死因子-α.

表6 病變皮膚組織lncRNA NEAT1表達量和炎癥因子mRNA相對表達量的關聯

Tab 6 Association between lncRNA NEAT1 relative expression of psoriatic lesions and relative expression of inflammatory cytokine mRNA

炎癥因子mRNA相對表達量lncRNA NEAT1相對表達量rPTNF-α mRNA0.342<0.001IL-6 mRNA0.315<0.001IL-8 mRNA0.1740.013IL-17 mRNA0.345<0.001IL-22 mRNA0.1460.037

lncRNA：長鏈非編碼RNA；NEAT1：核富集轉錄物1；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細胞介素.

文獻報道，TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22與銀屑病疾病進展非常相關[3,16]。因此，為進一步確定lncRNA NEAT1與銀屑病炎癥的關系，本研究檢測了銀屑病患者病變皮膚組織中TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22水平，并與lncRNA NEAT1在病變皮膚組織中表達量做關聯分析，結果顯示病變皮膚組織中lncRNA NEAT1表達水平與TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22水平呈正相關，表明lncRNA NEAT1可能是通過促進炎癥反應來加重患者的疾病活動度，這可能與其在系統性紅斑狼瘡或動脈粥樣硬化中的促炎作用類似。lncRNA NEAT1通過直接調控炎癥反應相關通路，如誘導MAPK途徑激活來促進TLR4介導的炎癥反應過程，從而誘導促炎因子的表達。此外，lncRNA NEAT1也可以通過形成paraspeckle，間接參與調控炎癥反應相關通路，比如NF-κB或 p38，繼而誘導促炎因子的表達[5-6,14-16]。

本研究不足之處：(1) 未深入評估lncRNA NEAT1影響銀屑病患者炎癥水平和疾病活動度的機制；(2) 研究樣本來自單中心且樣本量較小，可能造成患者選擇偏倚和統計效能下降；(3) 未評估lncRNA NEAT1在銀屑病患者轉歸中的作用。