miR-378a-3p靶向PKM2基因對食管鱗癌細胞Eca-109凋亡及能量代謝的影響

阿依提拉·熱合麥提江,屈 園,帕力旦·艾孜提,張法煌,朱世茂,胡慧玲,李 卉

(1新疆醫科大學基礎醫學院生物化學教研室,烏魯木齊 830011;2新疆醫科大學公共衛生學院;3新疆醫科大學中心實驗室;#共同第一作者;*通訊作者,E-mail:huihui922@126.com)

食管癌是近年來常見的惡性消化道腫瘤之一,報道顯示全球食管癌發病率和死亡率分別位列第8位和第6位[1]。雖然目前食管癌的診斷和治療手段已有很大的改進,但多數食管癌患者發現時已到中晚期,錯過了最佳的手術時機,5年生存率低于15%[2]。

腫瘤細胞區別于正常細胞,這是因為代謝方式的不同而引起的。腫瘤細胞里將近50%的ATP是通過糖酵解途徑合成的,這種即使在氧氣充足下,惡性腫瘤細胞依然通過糖酵解獲取能量并產生乳酸的效應方式稱為Warburg效應[3]。越來越多的研究發現,丙酮酸脫氫酶(PKM2)是糖酵解途徑中重要的限速酶,PKM2在增殖的細胞,尤其在腫瘤細胞中高表達,且在Warburg效應和腫瘤發生、浸潤轉移中發揮重要作用[4,5]。

micro-RNA是一類微小的內源表達的單鏈非編碼RNA[6],其長度在18-24個核苷酸左右,它通過與靶基因3′-UTR區互補配對,轉錄后對基因的表達進行調控,進而參與調控細胞的生長、分化等多個過程。近年來研究表明[7],mi-RNA在食管癌中的異常表達具有穩定性和特異性,可以作為食管癌診斷的分子標志物。miR-378定位于人染色體5q32,在2005年被證實在腫瘤細胞株中表達[8]。

癌癥越來越被視為一種代謝相關疾病,腫瘤相關的能量調節已經作為腫瘤治療的生化途徑和藥物靶點。在過去的幾年里,分子和細胞研究明確地強調了癌基因和腫瘤抑制因子與癌癥糖酵解的關系,而且研究[9]表明mi-RNA在介導這種代謝轉變中發揮重要作用。

本實驗通過研究miR-378a-3p與PKM2基因的關系及其對Eca-109細胞的作用,驗證miR-378a-3p調控關系,探索miR-378a-3p是否能成為未來食管癌臨床治療的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RMPI1640培養基(美國Hyclone公司)、胎牛血清(FBS)(美國Hyclone公司)、胰酶細胞消化液(美國Gibco公司)、Opti-MEM(美國Gibco公司)、SanPerp柱式質粒DNA小量抽提試劑盒(上海生工)、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(美國Thermo公司)、BSA蛋白檢測試劑盒(美國Thermo公司)、Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)、兔抗人PKM2抗體(美國Abcam公司)、ATP檢測試劑盒(中國索萊寶公司)、Western blot顯色試劑盒(Invitrogen公司,美國)。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養、質粒轉染 將食管癌細胞株Eca-109接種于含10%胎牛血清和含青霉素與鏈霉素雙抗的RPMI1640培養基中,置于37 ℃、CO2體積分數為5%和濕度飽和的細胞培養箱中培養,每隔48 h換液一次,待細胞貼壁80%左右時按實驗要求進行傳代。將實驗分為4組:①空白對照組;②陰性對照組;③miR-378a-3p轉染24 h組;④miR-378a-3p轉染48 h組。取對數生長期的Eca-109細胞進行電轉染(轉染條件:電壓280 V,電阻550 Ω,電容900 CF),之后每孔加2 ml接種于6孔板中。貼壁后換液,在37 ℃、5% CO2條件下常規培養,24 h及48 h后收取細胞。

1.2.2 蛋白表達量檢測實驗 取轉染24 h和48 h后的Eca-109細胞,裂解提取總蛋白。BCA法測定細胞裂解物的蛋白含量,取等量蛋白質以10% SDS-PAGE分離并轉移至PVDF膜上,單克隆抗體4 ℃孵育過夜。PBST洗去一抗,二抗室溫孵育2 h。洗滌,ECL試劑盒顯色,凝膠成像系統采集成像。β-actin作為內參。成像結果通過ImageJ灰度分析軟件讀取灰度值,以PKM2/β-actin進行分析對比。

1.2.3 ATP含量檢測實驗 先收集細胞到離心管內,棄上清,按照細胞數量提取液體積(ml)為1 ∶500-1 ∶1 000的比例,超聲波破碎1 min(冰浴,強度20%或200 W,超聲2 s,停1 s),10 000g4 ℃離心3 min,取上清,置冰上測。把工作液與標準液充分混勻后,立即測定340 nm下10 s的吸光值A1,然后將比色皿連同反應液一起放入37 ℃水浴中反應3 min,拿出擦拭干凈立即測定其在190 s時的吸光值A2。分別計算ΔA測定=A2測定管-A1測定管,ΔA標準=A2標準管-A1標準管。

ATP含量按如下公式計算(按細胞密度計算):

ATP含量(μmol/106cell)

=ΔA測定÷(ΔA標準÷C標準)×V提取÷5

=0.125×ΔA測定÷ΔA標準

其中,C標準管:標準濃度液,0.625 μmol/ml;V提取:加入的提取液體積,1 ml;5:細胞或細菌總數,5×106個。

1.2.4 細胞凋亡實驗 收集轉染后24 h和48 h各組Eca-109細胞,消化和PBS洗滌后,加入200 μl結合緩沖液重懸細胞,經膜聯蛋白-Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和碘化丙啶(PI)避光孵育15 min后,流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。其中,每組實驗均重復3次。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 miR-378a-3p對PKM2蛋白表達的影響

與空白對照組相比,陰性對照組PKM2相對蛋白水平無顯著差異。與空白對照組和陰性對照組相比,miR-378a-3p轉染后24 h及miR-378a-3p轉染后48 h PKM2蛋白水平明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05,見圖1),且miR-378a-3p轉染后48 h較miR-378a-3p轉染后24 h組下降趨勢更明顯。

2.2 miR-378a-3p表達對能量代謝的影響

與空白對照組相比,陰性對照組ATP產量略有增高,差異無統計學意義。與空白對照組和陰性對照組相比,miR-378a-3p轉染后24 h及miR-378a-3p轉染后48 h組ATP含量明顯降低,差異有統計學意義(P<0.01,見圖2)。

2.3 miR-378a-3p表達對食管癌細胞凋亡的影響

空白對照組、陰性對照組、miR-378a-3p轉染后24 h和48 h組細胞凋亡率分別為4.05%±0.888 8%,4.63%±0.434 9%,15.65%±1.377 2%和17.10%±3.472 8%。由此可以看出:空白對照組與陰性對照組細胞凋亡率無明顯變化;與空白對照組和陰性對照組相比,miR-378a-3p轉染后24 h及miR-378a-3p轉染后48 h細胞凋亡率顯著增高,差異有統計學意義(P<0.001,見圖3)。

與空白對照組和陰性對照組比較,*P<0.05

與空白對照組和陰性對照組比較,**P<0.01

3 討論

食管癌是常見的消化道腫瘤之一。它依病理分型,主要分為食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)和食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)兩大類[10]。全球范圍內的食管癌約90%是食管鱗癌,我國是世界上食管癌高發區之一,目前,食管癌總的5年生存率僅為15%-25%,每年有超過15萬人死于食管癌[11]。因此,早期診斷及有效治療食管癌極其重要。

與空白對照組和陰性對照組比較,***P<0.001

食管癌發病原因尚不十分清楚,越來越多研究證明食管癌發生是一個多因素、多基因、多階段共同作用的結果,是一個因許多致癌基因、抑癌基因結構與功能發生異常不斷累積與協同作用的過程。因此,通過尋找新的生物標記物,提高早期診斷的精準率,揭示及干預疾病分子調控機制,是降低食管癌死亡率的有效途徑[12]。

腫瘤細胞最顯著的特征為代謝異常,其能量代謝與正常細胞有很大不同。研究顯示,這是腫瘤細胞快速增殖并轉移的分子生物學基礎[13]。Warburg效應是一種低效能量產生方式。丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)催化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)與ADP反應生成丙酮酸和ATP,是糖酵解的關鍵酶之一。研究表明[14],M2型丙酮酸激酶(M2 type of pyruvate kinase,PKM2)作為PK的亞型之一,在腫瘤的形成發展中起著重要的作用。PKM2作為多個mi-RNA下游共同的靶基因,通過不同的途徑作用于腫瘤細胞,最終促進腫瘤的生長。Tang等[15]研究發現PKM2在多種惡性腫瘤中表達升高,且與腫瘤耐藥性及預后相關,在腫瘤的發生發展中發揮重要的調控作用。

目前,miR-378的抗腫瘤作用受到廣泛的關注。微小RNA(mi-RNA)是一類可調控基因表達的內源性非編碼單鏈小分子RNA,不僅與多種腫瘤疾病的診斷、預后和治療密切相關,還可以作為致癌或抑癌基因參與腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡等生物學行為[16]。研究顯示,miR-378在一些惡性腫瘤中如胃癌、結直腸癌、乳腺癌中表達下調,有著抑癌基因的作用;但同時miR-378在諸如白血病、腎母細胞瘤、肺癌以及胰腺腫瘤中表達卻是上調的,這些研究表明了miR-378在腫瘤發生、發展的過程中發揮著重要作用,且作用機制較為復雜[17]。miR-378包括miR-378a-3p和miR-378a-5p。有研究表明,miR-378a-3p可以通過靶向GOLT1A增強他莫昔芬對乳腺癌細胞反應能力。此外,miR-378a-3p是結直腸癌的預后影響因素。王曉龍等[18]發現,食管癌細胞中miR-378a-3p的相對表達量明顯低于正常細胞。大量研究發現,調控miRNA-155的表達可影響細胞的增殖及凋亡等生物學活動[19,20]。然而,關于miR-378a-3p在食管癌進展的生物學作用和潛在的分子機制尚不清楚。因此,尋找新的食管癌診斷及治療靶點,從而提高食管癌的早診早治非常重要[21]。

為了探討miR-378a-3p與PKM2基因的關系,以及對食管鱗癌細胞Eca-109凋亡及能量代謝的影響,本實驗將miR-378a-3p轉染入Eca-109細胞24 h和48 h后,流式細胞儀檢測miR-378a-3p對Eca-109細胞凋亡的影響,研究結果顯示,轉染miR-378a-3p組能夠顯著地增加Eca-109的凋亡。用紫外分光光度法檢測ATP含量可見轉染miR-378a-3p后ATP產量較對照組明顯降低,Western blotting檢測miR-378a-3p干預后PKM2蛋白水平的變化,研究結果顯示,miR-378a-3p轉染后PKM2表達降低。綜合上述結果提示:作為有氧酵解途徑中的關鍵酶PKM2,miR-378a-3p通過抑制其表達,從而干擾腫瘤細胞的能量代謝,進而增加腫瘤細胞的凋亡。本研究為食管癌的靶向治療及進一步研究提供了理論依據,對miR-378a-3p功能及作用機制的研究,有助于探尋新的食管癌候選診斷,治療靶點,并揭示食管癌進展過程中的生物學機制。