稻草秸稈的酶解糖化及發酵生產衣康酸

劉 蘭，倪 賽，任雨萍，由維清，印培民*

(1.江西省科學院微生物研究所，江西 南昌 330000；2.江西科院生物新材料有限公司，江西 南昌 330000)

我國每年產生大量的農林廢棄物，一般被焚燒、填埋或作為堆肥使用，不僅浪費資源還污染環境[1]。如何有效資源化廢棄物對資源利用和產業升級具有重要意義[2-3]。秸稈是我國主要的農林廢棄物，經降解可轉化為糖類(纖維素和半纖維素)，進而轉化為可被微生物利用的還原糖，用于生產各種化工產品和燃料，可解決糧食資源短缺的問題[4]。

衣康酸(itaconic acid)是第五大有機酸(前4位依次為：檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸和蘋果酸)[5]。衣康酸發酵的最適碳源是葡萄糖，其價格較淀粉等碳源要高，無法滿足實際工業生產；但由于衣康酸發酵菌株缺乏能夠水解糖類的酶或其酶活很低，無法直接有效利用淀粉等大分子糖類，而需要經過預處理將其轉化為可被衣康酸發酵菌株利用的小分子糖類(如葡萄糖)，這無疑會增加生產成本。因此，尋求非糧可再生原料生產衣康酸是降低生產成本的有效策略。1978年，Kobayashi等研究發現木材廢棄物經水解后，其水解液可被利用生產衣康酸。Saha等[6]研究發現，部分土曲霉能夠利用木糖等五碳糖生產衣康酸，為充分利用木質纖維素原料水解糖類奠定了基礎。Saha等[7]用稀酸預處理小麥秸稈，經酶解獲得酶解液，將酶解液稀釋1 000倍并額外添加葡萄糖后，利用土曲霉發酵生產衣康酸的產量約為正常發酵的一半。Jimenez-Quero等[8]將麥麩和玉米芯進行水解得到水解液，發現兩種土曲霉無法在稀釋10倍的水解液中發酵生產衣康酸。Pedroso等[9]將米糠經磷酸預處理及脫毒處理后，利用土曲霉發酵生產衣康酸的產量為1.9 g·L-1。Krull等[10]將小麥殼進行NaOH溶液預處理后制得水解液，利用土曲霉發酵生產衣康酸的產量為0.6 g·L-1；水解液經蛋白質變性和離子交換樹脂脫毒后，衣康酸產量提高到27.7 g·L-1。

作者以稻草秸稈酶解糖化液為原料，利用土曲霉KY-013發酵生產衣康酸；研究超微粉碎、高溫蒸煮、稀硫酸和NaOH溶液等預處理方式對稻草秸稈酶解糖化的影響，并分析預處理前后及酶解后稻草秸稈中組分含量的變化，旨在充分利用秸稈資源，降低生產成本，為農業廢棄物纖維素資源的開發利用開辟可行的途徑。

1 實驗

1.1 材料與儀器

稻草秸稈，取自江西省農業科學院水稻試驗田；纖維素酶(酶活力為494.6 IU·g-1)、土曲霉(Aspergillusterreus)KY-013均由江西科院生物新材料有限公司提供。

UV-6000PC型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；HPLC-20AD型液相色譜儀、TOSOh TSKgel-OApakP+Oapak A型分析柱(7.8 mm×300 mm)、RID-10A型示差檢測器，日本島津公司；MKCA6-2J型超微粉碎機，MASUKO SANGYO；PC350×500型錘式粉碎機，鄭州恒星重型設備有限公司；TY36型小型盤式粉碎機，山東濟寧曲阜天陽機械制造有限公司。

1.2 培養基

斜面培養基(g·L-1)：葡萄糖20、玉米漿干粉8.0、NaCl 20、瓊脂15。

種子培養基(g·L-1)：葡萄糖55.5、玉米漿干粉1.2、NH4NO35.0、MgSO4·7H2O 2.0、pH值3.0。

發酵培養基(g·L-1)：稻草秸稈水解液、葡萄糖、木糖、NH4NO33、MgSO4·7H2O 1.8、玉米漿干粉 0.48、KH2PO40.05、ZnSO40.02、pH值3.0。

1.3 稻草秸稈粉的制備

將自然風干的稻草秸稈切成1～2 cm小段，用自來水沖洗干凈，室內風干后，105 ℃下干燥2 h，儲于干燥器中；取1 kg干燥稻草秸稈依次經錘式粉碎機和盤式粉碎機粉碎后，過60目篩，即得稻草秸稈粉。

1.4 稻草秸稈預處理方式的篩選

1.4.1 超微粉碎預處理

稱取100 g稻草秸稈粉置于2 000 mL錐形瓶中，加入1.9 kg水，混勻后得到稻草混合液。將超微粉碎機調零并設置參數為500 μm，將稻草混合液加入磨機，并不斷調小磨機間距，使得稻草混合液依次通過每個節點(500 μm、300 μm、250 μm、200 μm、150 μm、100 μm)，然后分別在粒徑為10 μm、20 μm、30 μm、40 μm、50 μm、60 μm條件下通過10次，抽濾分離，60 ℃干燥至恒重，置于干燥器中，備用。以無處理作為空白對照。

1.4.2 高溫蒸煮預處理

稱取10 g稻草秸稈粉置于500 mL錐形瓶中，加入190 g水，分別經120 ℃、160 ℃、180 ℃蒸煮處理1 h，抽濾分離，60 ℃干燥至恒重，置于干燥器中，備用。以無處理作為空白對照。

1.4.3 稀硫酸預處理

稱取10 g稻草秸稈粉置于250 mL錐形瓶中，按固液比1∶10(g∶mL)分別加入質量分數為1%、5%、10%、15%、20%和25%的稀硫酸，置于恒溫搖床中，于60 ℃、200 r·min-1振蕩處理24 h，抽濾分離，用蒸餾水洗滌至中性，60 ℃干燥至恒重，置于干燥器中，備用。以蒸餾水處理作為空白對照。

1.4.4 NaOH溶液預處理

稱取10 g稻草秸稈粉置于250 mL錐形瓶中，按固液比1∶7.5(g∶mL)分別加入質量分數為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的NaOH溶液，置于恒溫搖床中，于30 ℃、200 r·min-1振蕩處理24 h，抽濾分離，用蒸餾水洗滌至中性，60 ℃干燥至恒重，置于干燥器中，備用。以蒸餾水處理作為空白對照。

1.5 稻草秸稈的酶解糖化

準確稱取2.5 g預處理后的稻草秸稈粉置于250 mL錐形瓶中，按固液比1∶20(g∶mL)加入pH值為4.8的檸檬酸緩沖液，然后加入一定量纖維素酶溶液，于50 ℃、200 r·min-1酶解48 h，以蒸餾水處理作為空白對照。每24 h取樣測定酶解液中還原糖和總糖的含量，按式(1)計算還原糖轉化率。

(1)

式中：A為酶解液中還原糖含量；B為預處理后的稻草秸稈粉質量；C為預處理前稻草秸稈粉質量；D為預處理前稻草秸稈粉中總糖含量。

采用DNS法[11]測定酶解液中還原糖含量，采用硫酸-苯酚法[12]測定酶解液中總糖含量，采用Van Soest法[13]測定NaOH溶液預處理前后以及酶解后稻草秸稈中纖維素、半纖維素和木質素的含量。

1.6 發酵生產衣康酸

參照文獻[14]進行。將安瓿管保藏的土曲霉KY-013菌種接種至斜面培養基中，30 ℃恒溫培養4 d后，置于4 ℃冰箱中保存，備用；用無菌水洗下斜面孢子，稀釋，使菌懸液孢子濃度為4.55×107個·mL-1；按10%接種量接種于100 mL種子培養基中，于30 ℃、220 r·min-1振蕩培養48 h；將培養好的種子液按10%接種量接種至40 mL發酵培養基中，于37 ℃、280 r·min-1振蕩培養6 d，即得衣康酸。

糖酸轉化率的測定：將發酵液經10 000 r·min-1離心10 min；取上清液，稀釋，用0.22 μm聚醚水性濾膜過濾，進行HPLC分析(檢測器為RID-10A型示差檢測器，流動相為0.75 mmol·L-1H2SO4，流速1.0 mL·min-1，柱溫45 ℃，進樣量10 μL)，測定發酵液中衣康酸和殘糖含量，按式(2)計算糖酸轉化率。

(2)

2 結果與討論

2.1 超微粉碎預處理對稻草秸稈酶解糖化的影響(圖1)

圖1 超微粉碎預處理對稻草秸稈酶解糖化的影響Fig.1 Effect of superfine pulverization pretreatment on enzymatic saccharification of rice straw

從圖1可知，稻草秸稈經超微粉碎預處理后進行纖維素酶酶解，粒徑10～60 μm的稻草秸稈酶解24 h的還原糖轉化率為31.50%～38.24%，酶解48 h的還原糖轉化率為44.40%～49.50%；酶解48 h的還原糖轉化率普遍高于酶解24 h的。因此，超微粉碎預處理的最優方式為錘式粉碎機、盤式粉碎機依次粉碎，得到50 μm粒徑的稻草秸稈酶解48 h的還原糖轉化率最高，為49.50%。實驗發現，50 μm和60 μm粒徑的稻草秸稈與纖維素酶的接觸面積最大，其纖維素的結晶度最低，在一定程度上提高了還原糖轉化率，但稻草秸稈中木質素結構并未被有效破壞，木質素去除率僅2.6%。因此，超微粉碎預處理的酶解效率不夠理想[15]。

2.2 高溫蒸煮預處理對稻草秸稈酶解糖化的影響(圖2)

從圖2可知，稻草秸稈分別經120 ℃ 、160 ℃和180 ℃蒸煮預處理1 h后進行纖維素酶酶解，酶解24 h的還原糖轉化率分別為48.06%、30.24%、29.16%，酶解48 h的還原糖轉化率分別為52.14%、33.81%、32.16%；酶解48 h的還原糖轉化率普遍高于酶解24

圖2 高溫蒸煮預處理對稻草秸稈酶解糖化的影響Fig.2 Effect of high temperature cooking pretreatment on enzymatic saccharification of rice straw

h的；120 ℃蒸煮預處理的酶解效果優于160 ℃和180 ℃。這是因為，高溫高壓會促使纖維素內部氫鍵斷裂，其脫落的羥基會增強纖維素的吸附能力，半纖維素和木質素脫離纖維素的包裹，并進一步水解和轉化，但溫度過高會一定程度破壞纖維素和半纖維素的結構，導致酶解效率降低，進而影響還原糖轉化率。因此，高溫蒸煮預處理的最優方式為120 ℃處理1 h，得到的稻草秸稈酶解48 h的還原糖轉化率最高，為52.14%。但高溫高壓不能改變木質素結構、有效去除木質素、降低纖維素結晶度，因此，其應用在一定程度上受到限制[16]。荊磊等[17]研究發現，稻草秸稈經160 ℃自水解預處理，在混合酶用量為40 FPU·g-1時，葡聚糖和木聚糖的總轉化率分別約為68%和45%，總糖轉化率近60%。

2.3 稀硫酸預處理對稻草秸稈酶解糖化的影響(圖3)

圖3 稀硫酸預處理對稻草秸稈酶解糖化的影響Fig.3 Effect of dilute sulfuric acid pretreatment on enzymatic saccharification of rice straw

從圖3可知，稻草秸稈分別經1%、5%、10%、15%、20%、25%的稀硫酸預處理后進行纖維素酶酶解，隨著稀硫酸質量分數的增加，還原糖轉化率總體呈降低的趨勢；在稀硫酸質量分數為1%時，酶解48 h的還原糖轉化率達到最高，為37.69%。這是因為，1%稀硫酸能明顯降低纖維素的平均聚合度、改變木質素的結構、增強反應能力、最大程度提高酶解效率。因此，稀硫酸預處理的最優方式為1%稀硫酸預處理稻草秸稈，酶解48 h的還原糖轉化率為37.69%。但稀硫酸在處理過程中會產生多種抑制發酵的產物[15]，并且稀硫酸預處理對木質素的去除率較低，只有16.67%。孫萬里等[18]曾報道，經酸預處理的稻草秸稈酶解的纖維素轉化率為43.4%、葡萄糖含量為24.1 g·L-1；經酸堿聯合處理的稻草秸稈酶解的纖維素轉化率為60.6%、葡萄糖含量為47.7 g·L-1。

2.4 NaOH溶液預處理對稻草秸稈酶解糖化的影響

經檢測，稻草秸稈中纖維素含量為34.8%、半纖維素含量為23.2%、木質素+灰分含量為18.38%。NaOH溶液預處理前后及酶解后，稻草秸稈中各組分含量變化如圖4所示。

從圖4可知，NaOH預處理后，纖維素含量增加15.66%；半纖維素損失率為10.05%；而木質素+灰分含量明顯降低，殘留量只有3.93%，損失率達到85.93%；酶解后殘渣中木質素+灰分含量增加48.69%。有研究報道，NaOH溶液預處理對纖維素含量變化無影響，半纖維素與木質素的損失比較大。此外，NaOH溶液預處理過程中，由于木質素、半纖維素溶出較多，使得纖維素充分暴露，增大了稻草秸稈的比表面積，提高了酶解效率[15,19]。

NaOH溶液預處理對稻草秸稈酶解糖化的影響如圖5所示。

從圖5可知，隨著NaOH質量分數的增加，還原糖轉化率呈先升高后降低的趨勢；在NaOH質量分數為1.5%時，酶解24 h和48 h的還原糖轉化率均達到最高，分別為61.94%和82.51%。纖維素酶會不斷將纖維素和半纖維素酶解成可利用還原糖，而木質纖維素的結構對纖維的結晶度、孔隙率及木質素的含量影響很大[20]。稻草秸稈經1.5%NaOH溶液預處理后，其稻草秸稈結構發生變化，木質素-碳水化合物復合體被破壞，使部分纖維素脫出，木質纖維素的內部結構更加疏松，酶對纖維素的可及度增加，此外稻草纖維的結晶度降低，稻草秸稈膨脹、孔隙率增加，且木質素被NaOH溶解后被溶出。因此，纖維素不斷被酶解糖化成葡萄糖，半纖維素被酶解成木糖和阿拉伯糖。酶解后殘渣中木質素含量較高，結晶度也較高，不僅可以用來提純木質素用作工業原料，也可以將酶解殘渣直接添加至聚乳酸中，制備新型生物可降解材料，實現木質纖維的全組分利用[21]。

綜上，結合李輝勇等[22]的研究結果，確定稻草秸稈的最佳預處理方式為：按固液比1∶7.5(g∶mL)加入質量分數為1.5%的NaOH溶液，于30 ℃、200 r·min-1振蕩處理24 h；結合沙如意等[12]的研究結果，確定最佳酶解工藝為：按固液比1∶20(g∶mL)加入pH值4.8的檸檬酸緩沖液，加入2.5 IU·g-1纖維素酶溶液，于50 ℃、200 r·min-1酶解48 h。

2.5 稻草秸稈酶解糖化液中還原糖的含量

稻草秸稈酶解糖化液的HPLC圖譜如圖6所示，稻草秸稈酶解糖化液中各還原糖的含量如圖7所示。

經單糖定量分析可知，稻草秸稈酶解糖化液中的還原糖主要有D-纖維二糖(16.214 min)、乳糖(17.890 min)、葡萄糖(19.026 min)、木糖(20.285 min)、阿拉伯糖(22.748 min)。其中，葡萄糖含量最高，酶解24 h的含量為17.62 g·L-1、酶解48 h的含量為23.44 g·L-1；其次為乳糖、木糖、D-纖維二糖、阿拉伯糖。據報道，稻草秸稈中主要還原糖為阿拉伯聚糖、半乳聚糖、葡聚糖和木聚糖[17]。經纖維素酶酶解后，阿拉伯聚糖被分解為阿拉伯糖，葡聚糖被完全分解為葡萄糖、不完全分解為D-纖維二糖，木聚糖被完全分解為木糖，而酶解糖化液中乳糖由半乳聚糖不完全分解得到。稻草秸稈經1.5%NaOH溶液預處理后，半纖維素和木質素脫除，因此由半纖維素水解而成的木糖含量明顯偏低，而纖維素更加高效水解為葡萄糖，因此還原糖中的葡萄糖含量最高。

2.6 利用稻草秸稈酶解糖化液發酵生產衣康酸

土曲霉KY-013利用NaOH溶液預處理后的稻草秸稈酶解糖化液發酵生產衣康酸的結果如表1所示。

從表1可知：

(1)稻草秸稈酶解糖化液中未額外添加葡萄糖和木糖時(1#～5#)，隨著酶解糖化液中葡萄糖和木糖濃度的增加，衣康酸的產量先升高后降低；在葡萄糖濃度為30 g·L-1、木糖濃度為3.5 g·L-1時，衣康酸產量達到最高，為9.78 g·L-1，糖酸轉化率為20.77%。這是因為，酶解糖化液雖然在一定條件下能被土曲霉KY-013發酵生產衣康酸，但1.5%NaOH溶液預處理稻草秸稈酶解糖化液中含有抑制土曲霉KY-013發酵的物質，使得發酵利用受阻；高濃度的酶解糖化液中抑制物濃度較高，此時雖然葡萄糖和木糖濃度高，但不足以應對抑制物的抑制作用；而低濃度的酶解糖化液中抑制物濃度較低，土曲霉KY-013對酶解糖化液中葡萄糖和木糖的發酵利用作用強于抑制物的抑制作用，因此衣康酸產量相對升高；當酶解糖化液中葡萄糖和木糖濃度很低時，又無法滿足土曲霉發酵對糖的需求，因此隨著酶解糖化液濃度的降低，衣康酸產量先升高后降低。另外，隨著酶解糖化液中葡萄糖和木糖濃度的增加，發酵液pH值逐漸減小、菌體干重逐漸升高、糖酸轉化率逐漸降低。

表1利用稻草秸稈酶解糖化液發酵生產衣康酸的結果

Tab.1 Results of production of itaconic acid by fermentation of enzymatic saccharification liquid of rice straw

(2)稻草秸稈酶解糖化液中額外添加葡萄糖和木糖時(6#～11#)，隨著酶解糖化液中葡萄糖和木糖濃度的增加，衣康酸產量逐漸升高；在葡萄糖濃度為80 g·L-1、木糖濃度為40 g·L-1時，衣康酸產量達到最高，為53.88 g·L-1；隨著酶解糖化液中葡萄糖和木糖濃度的增加，糖酸轉化率逐漸升高、發酵液pH值逐漸減小、菌體干重逐漸下降。

表明，底物濃度直接影響微生物的生長和代謝，發酵過程中碳源濃度過高或過低均會不同程度影響菌株的生長[23]。

3 結論

以稻草秸稈生物轉化制備衣康酸為目標，選擇稻草秸稈酶解糖化液為原料，利用土曲霉KY-013發酵生產衣康酸。研究了超微粉碎、高溫蒸煮、稀硫酸和NaOH溶液等預處理方式對稻草秸稈酶解糖化的影響，確定稻草秸稈的最佳預處理方式為：按固液比1∶7.5(g∶mL)加入質量分數為1.5%的NaOH溶液，于30 ℃、200 r·min-1振蕩處理24 h；最佳酶解工藝為：按固液比1∶20(g∶mL)加入pH值4.8的檸檬酸緩沖液，加入2.5 IU·g-1纖維素酶溶液，于50 ℃、200 r·min-1酶解48 h。在此條件下，還原糖轉化率達到最高，為82.51%。HPLC分析表明，酶解糖化液中還原糖成分為D-纖維二糖、乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖。在不添加葡萄糖和木糖條件下，酶解糖化液中葡萄糖濃度為30 g·L-1、木糖濃度為3.5 g·L-1時，衣康酸產量達到最高，為9.78 g·L-1；隨著添加葡萄糖和木糖濃度的增加，土曲霉KY-013對稻草秸稈糖化液的利用效率逐漸升高，衣康酸產量逐漸升高，最終達53.88 g·L-1。

本研究表明土曲霉KY-013能利用合適底物濃度的酶解糖化液發酵生產衣康酸，為衣康酸工業化生產原料找到非糧的替代品，也為生物發酵行業碳源的原料供應提供了新的途徑。