基于LC-MS/MS的咖啡酰奎寧酸異構(gòu)體鑒別方法研究

李麗麗，馬雙雙，趙恒強(qiáng)，劉 偉，王 曉

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

咖啡酰奎寧酸類化合物是植物中常見的一類天然酚酸類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤等生物活性，是天然藥物發(fā)揮藥效活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[1-2]。咖啡酰奎寧酸是由奎寧酸和不同數(shù)目的咖啡酰基通過酯化反應(yīng)縮合而成[3]。自然界中的咖啡酰奎寧酸包括單咖啡酰奎寧酸、二咖啡酰奎寧酸、三咖啡酰奎寧酸和多咖啡酰奎寧酸，其中單咖啡酰奎寧酸和二咖啡酰奎寧酸在植物中廣泛存在[4]。

圖1 單咖啡酰奎寧酸和二咖啡酰奎寧酸的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecule structures of monocaffeoylquinic acids and dicaffeoylquinic acids R represents caffeoyl group(R代表咖啡酰基)

咖啡酰奎寧酸的分析方法包括高效液相色譜法[5-6]、毛細(xì)管電泳法[7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[8-9]等。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法集成了液相色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度特點(diǎn)，在咖啡酰奎寧酸的分離分析中得到更為廣泛的應(yīng)用。由于咖啡酰基和奎寧酸的酯化位點(diǎn)不同，咖啡酰奎寧酸類化合物存在許多位置異構(gòu)體[10-11]。如金銀花中分離出單咖啡酰奎寧酸類化合物——3-O-咖啡酰奎寧酸、4-O-咖啡酰奎寧酸和5-O-咖啡酰奎寧酸，以及二咖啡酰奎寧酸類化合物——3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸[12]。這些化合物在分子結(jié)構(gòu)上咖啡酰基數(shù)目不同或酯化位置不同(圖1)，而結(jié)構(gòu)上的差異則會引起藥效活性的顯著不同。研究發(fā)現(xiàn)二咖啡酰奎寧酸類化合物清除DPPH自由基和超氧陰離子的能力高于單咖啡酰奎寧酸類化合物，具有更強(qiáng)的抗氧化活性[13]。4,5-二咖啡酰奎寧酸通過激活瞬時(shí)受體電位香草酸受體1(TRPV1)抑制炎癥反應(yīng)，而其它咖啡酰奎寧酸化合物未發(fā)現(xiàn)這種作用機(jī)制[14]。因此，咖啡酰奎寧酸位置異構(gòu)體的準(zhǔn)確識別對植物功效物質(zhì)的開發(fā)具有重要意義。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，咖啡酰奎寧酸的位置異構(gòu)體在MS/MS分析下具有相同的碎片離子，給其定性帶來了困難。不同碰撞能誘導(dǎo)的二級質(zhì)譜裂解特征可對不同位置異構(gòu)體進(jìn)行區(qū)分[15-16]。本研究對單咖啡酰奎寧酸和二咖啡酰奎寧酸位置異構(gòu)體的色譜保留和不同碰撞能下的二級質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以實(shí)現(xiàn)LC-MS/MS分析下的快速鑒別。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

乙腈、甲醇(色譜級,德國默克公司)，甲酸(色譜級,德國Honeywell Fluka)，3-O-咖啡酰奎寧酸、4-O-咖啡酰奎寧酸、5-O-咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸及4,5-O-二咖啡酰奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司;超高效液相色譜儀(ACQUITY,H-Class,美國沃特世)，飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF-MS，Impact Ⅱ,德國布魯克);超純水由Millipore Direct-Q 8 UV-R超純水系統(tǒng)(美國)制備。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

將標(biāo)準(zhǔn)品3-O-咖啡酰奎寧酸、4-O-咖啡酰奎寧酸、5-O-咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸用甲醇-水(1∶1，體積比) 溶液溶解，配制成1 mg/mL的母液。

1.3 液相色譜條件

將3-O-咖啡酰奎寧酸、4-O-咖啡酰奎寧酸、5-O-咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸在不同洗脫梯度下進(jìn)行分析。色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-Aq C18柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm，美國)，流速為0.4 mL/min，柱溫40 ℃。流動相A為含有0.1%甲酸的水溶液，流動相B為純乙腈溶液，設(shè)置不同的洗脫梯度(見表1)。

表1 不同洗脫梯度下的流動相組成Table 1 Composition of mobile phases with different elution gradients

1.4 MS/MS條件

在正離子模式下進(jìn)行采集。質(zhì)量數(shù)范圍為50～1 000，毛細(xì)管電壓3 500 V，霧化氣壓力30 kPa,干燥氣流速4 L/min，干燥氣溫度200 ℃，碰撞池碰撞能10 eV，傳輸時(shí)間80 μs，碰撞池射頻電壓振幅750 Vpp,脈沖前等待時(shí)間8 μs,二級碰撞能設(shè)置為15～80 eV。

1.5 金銀花中咖啡酰奎寧酸的分析

稱取金銀花100 mg，加入1 mL的甲醇-水(1∶1，體積比)溶液，渦旋5 min。離心10 min，取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析。色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-Aq C18柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm),流速為0.4 mL/min,柱溫為40℃。流動相A為含有0.1%甲酸的水溶液，流動相B為純乙腈溶液。洗脫梯度設(shè)置為：0～5 min，7% B；5～10 min，7%～10% B；10～13 min，10%～25% B；13～16 min，25%～33% B；16～17 min，33%～50% B；17～19 min，50% B；19～19.1 min，50%～5% B；19.1～23 min，5% B。質(zhì)譜條件設(shè)置如下：毛細(xì)管電壓3 500 V,霧化氣壓力200 kPa,干燥氣流速8 L/min,干燥氣溫度200 ℃,碰撞池碰撞能7 eV，傳輸時(shí)間60 μs，碰撞池射頻電壓振幅750 Vpp,脈沖前等待時(shí)間5 μs，二級碰撞能設(shè)置為15～45 eV。

1.6 數(shù)據(jù)處理

超高效液相色譜和高分辨質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)由Data Analysis 軟件(德國布魯克)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。對不同碰撞能下的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，導(dǎo)出譜圖中的母離子、子離子以及強(qiáng)度信息。并提取出不同洗脫梯度下單咖啡酰奎寧酸和二咖啡酰奎寧酸的保留時(shí)間數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單咖啡酰奎寧酸和二咖啡酰奎寧酸的色譜保留分析

使用Agilent Poroshell 120 SB-Aq C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)，在不同的洗脫梯度下，單咖啡酰奎寧酸和二咖啡酰奎寧酸的保留時(shí)間見表2。單咖啡酰奎寧酸在C18柱上的保留較弱，洗脫時(shí)間在前。而二咖啡酰奎寧酸在C18柱上的保留較強(qiáng)，洗脫時(shí)間在后。咖啡酰基的增加減小了咖啡酰奎寧酸的極性，使得其在C18色譜柱的保留增強(qiáng)。洗脫梯度改變，咖啡酰奎寧酸保留時(shí)間的絕對值發(fā)生變化，但其洗脫順序未發(fā)生改變。單咖啡酰奎寧酸在C18色譜柱的6個(gè)不同梯度下的洗脫順序均為5-O-咖啡酰奎寧酸、4-O-咖啡酰奎寧酸、3-O-咖啡酰奎寧酸，而二咖啡酰奎寧酸的洗脫順序均為3,4-O-二咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸。該色譜保留特征可為咖啡酰奎寧酸位置異構(gòu)體的鑒別提供參考。

表2 單咖啡酰奎寧酸和二咖啡酰奎寧酸在不同洗脫梯度下的保留時(shí)間Table 2 Retention times of monocaffeoylquinic acids and dicaffeoylquinic acids with different elution gradients t/min

2.2 單咖啡酰奎寧酸的二級質(zhì)譜分析

3-O-咖啡酰奎寧酸、4-O-咖啡酰奎寧酸和5-O-咖啡酰奎寧酸是由一個(gè)咖啡酸和奎寧酸酯化而成。在低碰撞能下，其二級質(zhì)譜圖(以3-O-咖啡酰奎寧酸為例)中主要信號離子包括母離子377和子離子215、163(圖2A、B)；在高碰撞能下，其主要信號離子包括子離子163、145、135、117(圖2C)。其中，信號離子163、145、135和117是咖啡酰基的特征子離子。隨著碰撞能的增加，母離子377的信號強(qiáng)度逐漸減弱，子離子163的信號強(qiáng)度逐漸增加，成為基峰。在碰撞能25～35 eV時(shí)，母離子377和子離子163的強(qiáng)度變化最為顯著。考察了3種碰撞能(25、30、35 eV)下377/163強(qiáng)度比值的變化情況，發(fā)現(xiàn)隨著碰撞能的增加，377/163的強(qiáng)度比值逐漸減小，此比值在單咖啡酰奎寧酸中的大小順序依次為3-O-咖啡酰奎寧酸、4-O-咖啡酰奎寧酸和5-O-咖啡酰奎寧酸(圖2D)。單咖啡酰奎寧酸的結(jié)構(gòu)區(qū)別是奎寧酸和咖啡酸的酯化位置不同，子離子163由酯鍵發(fā)生斷裂產(chǎn)生。分析結(jié)果說明單咖啡酰奎寧酸中3-O-咖啡酰奎寧酸最難發(fā)生裂解，5-O-咖啡酰奎寧酸最易發(fā)生裂解，這與其幾何結(jié)構(gòu)、空間位阻和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)。

圖2 不同碰撞能下,3-O-咖啡酰奎寧酸的二級質(zhì)譜圖(A～C)和單咖啡酰奎寧酸中377/163的強(qiáng)度比值分布圖(D)Fig.2 MS/MS spectra of 3-O-caffeoylquinic acid (A-C) and intensity ratios of 377/163(D) at different collision energiesA:25 eV;B:35 eV;C:45 eV

2.3 二咖啡酰奎寧酸的二級質(zhì)譜分析

3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸是由2個(gè)咖啡酸和奎寧酸酯化而成。相對于單咖啡酰奎寧酸，在二級質(zhì)譜分析時(shí)，二咖啡酰奎寧酸首先丟失1個(gè)咖啡酰基，出現(xiàn)質(zhì)量數(shù)為377的信號峰。二咖啡酰奎寧酸在低碰撞能下(3,5-O-二咖啡酰奎寧酸為例)，主要信號離子包括母離子539和子離子377(圖3A、B)，在高碰撞能下，其主要信號離子包括子離子377、215、163、145、135，子離子163成為基峰(圖3C)。隨著碰撞能的增加，母離子539的信號強(qiáng)度逐漸減弱。子離子377的信號強(qiáng)度在25～35 eV范圍內(nèi)隨著碰撞能的增加而顯著增強(qiáng)，在35～45 eV范圍內(nèi)則隨著碰撞能的增加顯著減弱。子離子163在35～45 eV顯著增強(qiáng)。在25、30、35 eV碰撞能下，母離子539和子離子377的強(qiáng)度比值(539/377)順序?yàn)?,5-O-二咖啡酰奎寧酸>3,4-O-二咖啡酰奎寧酸>3,5-O-二咖啡酰奎寧酸(圖3D)。在35、40、45 eV碰撞能時(shí)，子離子377和163的強(qiáng)度比值(377/163)順序?yàn)?,5-O-二咖啡酰奎寧酸>4,5-O-二咖啡酰奎寧酸>3,4-O-二咖啡酰奎寧酸(圖3E)。通過二咖啡酰奎寧酸母離子539和子離子377的強(qiáng)度變化趨勢，結(jié)合單咖啡酰奎寧酸的裂解規(guī)律，推測3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸分別首先發(fā)生5-位、4-位和5-位的酯鍵斷裂得到子離子377。結(jié)果說明由于二咖啡酰奎寧酸中咖啡酰基取代位置不同造成了其空間位阻、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的差異，其中，4,5-O-二咖啡酰奎寧酸最難發(fā)生裂解，3,5-O-二咖啡酰奎寧酸最易發(fā)生裂解。

圖3 不同碰撞能下，3,5-O-二咖啡酰奎寧酸的二級質(zhì)譜圖(A～C),以及二咖啡酰奎寧酸中539/377(D)、377/163(E)的強(qiáng)度比值分布圖Fig.3 MS/MS spectra of 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (A-C) and intensity ratios of 539/163(D) and 377/163(E) at different collision energiesA:25 eV;B:35 eV;C:45 eV

2.4 實(shí)際應(yīng)用

圖4 金銀花中咖啡酰奎寧酸的提取離子流色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatogram of caffeoylquinic acids in honeysuckle1.5-O-caffeoylquinic acid,2.4-O-caffeoylquinic acid,3.3-O-caffeoylquinic acid,4.3,4-di-O-caffeoylquinic acid,5.3,5-di-O-caffeoylquinic acid,6.4,5-di-O-caffeoylquinic acid

單咖啡酰奎寧酸的二級質(zhì)譜裂解特征碎片離子為215、163、145、135、117。二咖啡酰奎寧酸的二級質(zhì)譜裂解特征碎片離子為377、215、163、145、135。在金銀花的LC-MS/MS分析中，通過精確質(zhì)量數(shù)和二級質(zhì)譜特征，基于4.4 min(峰1)，9.1 min(峰2)和9.4 min(峰3)識別出單咖啡酰奎寧酸類成分，基于15.4 min(峰4)、15.7 min(峰5)和16.0 min(峰6)識別出二咖啡酰奎寧酸類成分(圖4)。對于單咖啡酰奎寧酸成分，377/163的強(qiáng)度比值在25 eV時(shí)依次為峰3(16.1)>峰2(3.4)>峰1(2.5)。對于二咖啡酰奎寧酸成分，539/377的強(qiáng)度比值在25 eV時(shí)依次為峰6(4.4)>峰4(3.2)>峰5(1.9)，377/163的強(qiáng)度比值在35 eV時(shí)依次為峰5(3.0)>峰6(1.7)>峰4(1.5)。同時(shí)參考洗脫順序，金銀花中峰1、峰2和峰3分別鑒別為5-O-咖啡酰奎寧酸、4-O-咖啡酰奎寧酸和3-O-咖啡酰奎寧酸，峰4、峰5和峰6分別鑒別為3,4-O-二咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸，并通過標(biāo)樣驗(yàn)證。

3 結(jié) 論

單咖啡酰奎寧酸和二咖啡酰奎寧酸是植物界中常見的多酚類化合物，由于咖啡酰基與奎寧酸的酯化位置不同，而存在很多位置異構(gòu)體。本研究對單咖啡酰奎寧酸和二咖啡酰奎寧酸的位置異構(gòu)體進(jìn)行了色譜和二級質(zhì)譜分析。咖啡酰基的增加減小了咖啡酰奎寧酸的極性，使其在C18色譜柱的保留增強(qiáng)。單咖啡酰奎寧酸的特征碎片離子有215、163、145、135、117，可通過母離子377和子離子163的強(qiáng)度比值(377/163)進(jìn)行區(qū)分。二咖啡酰奎寧酸的特征碎片離子有377、215、163、145、135，可通過母離子539、子離子377和163的強(qiáng)度比值(539/377、377/163)進(jìn)行區(qū)分。咖啡酰奎寧酸類化合物的色譜保留和質(zhì)譜裂解規(guī)律的揭示為其位置異構(gòu)體的快速鑒別提供了方法指導(dǎo)。