超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定血液中115種農藥

杜秋瑤，張云峰，王繼芬，王 璐，常 靖，董林沛，吳小軍，劉冰潔

(1.中國人民公安大學 偵查與刑事科學技術學院，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038；3.農業農村部環境保護科研監測所，天津 300191；4.愛博才思亞太應用支持中心，北京 100015)

在臨床和法醫毒理學領域，常需對血液、尿液、胃內容物和內臟器官等生物檢材中的毒物進行篩查和定量，以尋找疾病或死亡的原因[1-3]。常見的毒物主要包括農藥、殺鼠劑、金屬毒物、揮發性毒物、臨床藥物、毒品、植物毒素、動物毒素、無機毒物9大類[4]。近年隨著農業的發展，農藥的種類日益增多，使用范圍不斷擴大。常見的農藥主要包括有機磷類、擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類、除草劑及其它水溶性農藥[4]。農藥的使用在提高農業生產效益的同時，也使各類有機污染物在環境和生物體內積累，對生態環境和人類健康構成了嚴重威脅。大量研究表明，農藥暴露與某些慢性疾病的發生率升高之間存在聯系，包括癌癥、帕金森病、阿爾茨海默病、多發性硬化癥、糖尿病、心血管疾病、慢性腎臟病及不育癥等[5]。慢性疾病的常見特征是細胞穩態的紊亂，它往往可以通過農藥對離子通道或酶受體等的擾動而誘發[5]。此外，由于意外、自殺或故意犯罪而導致的急性農藥中毒案例也時見報道[6]。目前對農藥殘留的高通量檢驗研究多集中在食品和環境樣本，研究者們建立了高通量檢測蔬菜、水果、茶葉、月柿、中藥材等樣本中農藥殘留的方法[7-11]。本文致力于建立人體血液中農藥的高通量檢驗方法，為臨床和法醫毒理學中農藥的快速檢驗提供技術支持。

檢測血液樣本中農藥的常用方法有氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)，配置紫外(UV)或二極管陣列檢測器(DAD)的高效液相色譜法(HPLC)以及液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)等[12-13]。其中串聯質譜技術因其高靈敏度、高專屬性和高通量的優勢，得到了廣泛應用[14]。由于氣相色譜在親水性、熱不穩定性和非揮發性農藥中的適用性受限，更多檢測以液相色譜-串聯質譜技術為主[15]。本研究結合實際中毒案例，選取了常見的115種農藥，包括59種有機磷類農藥、19種擬除蟲菊酯類農藥、17種氨基甲酸酯類農藥、17種除草劑，以及昆蟲生長調節劑類殺蟲劑噻嗪酮、人工合成的沙蠶毒素的類似物殺蟲單、低毒性殺菌劑三唑酮(詳見表1)。結合超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)技術進行分析研究，通過優化分析條件和提取凈化方式，建立了同時測定血液中115種農藥的方法。該方法簡單高效，實現了一針進樣同時對百種農藥進行分析的目的，對臨床和法醫毒物檢驗工作具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

LC-30A HPLC儀器(日本Shimadzu公司)，配備兩個LC-30A泵，SIL-30A自動進樣器，CTO-30A恒溫柱室和DGU-30A脫氣機；具有Turbo VTM離子源的5500 QTRAP三重四極桿質譜系統(美國Sciex公司)；Milli-Q去離子水系統(法國Millipore公司)；DHC-16500臺式高速離心機(澳洲Kewlab公司)；Vortex-Genie2可調速渦旋混合器(美國SI公司)；移液器和2 mL離心管(德國Eppendorf公司)。

115種農藥標準品(純度> 95%，德國Dr.Ehrenstorfer)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸、甲酸銨(HPLC級，美國Fisher Scientific)；空白血由首都醫科大學附屬復興醫院提供。

1.2 標準溶液的制備

用甲醇將質量濃度為10.0 μg/mL的混合標準品溶液稀釋至2.0 μg/mL，制得標準儲備溶液，將其在-20 ℃密封避光儲存。使用時用甲醇將標準儲備液稀釋成1.0 μg/mL的標準中間溶液，再逐級稀釋為200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 ng/mL的標準工作液，4 ℃下密封避光保存。精確配制1.0 mol/L的甲酸銨標準儲備液，4 ℃下密封避光保存。

1.3 樣品的前處理

準確移取200 μL樣品于2 mL離心管中，加入1 000 μL甲醇作沉淀劑，渦旋振蕩2 min，以12 000 r/min離心10 min，取上清液于配套液質進樣瓶中，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 液相色譜條件

Kinetex Biphenyl色譜柱(100 mm × 3.0 mm，2.6 μm)，柱溫40 ℃，進樣量2 μL。流動相：A相為含5 mmol/L甲酸銨的水溶液；B相為含5 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液；流速0.5 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min，3% B；0.5～1.1 min，3%～40% B；1.1～2.0 min，40%～60% B；2.0～7.0 min，60%～80% B；7.0～10.0 min，80%～83% B；10.0～10.1 min，83%～95% B；10.1～13.0 min，95%～98% B；13.0～15.5 min，98% B；15.5～15.6 min，98%～3% B；15.6～19.0 min，3% B。

1.5 質譜條件

離子源和掃描方式：電噴霧電離正離子模式(ESI+)和電噴霧電離負離子模式(ESI-)同時切換掃描；檢測方式：Scheduled MRM；噴霧電壓IS：5 500 V(ESI+)/-4 500 V(ESI-)；霧化氣(GS1)：379 225 Pa，離子源溫度(TEM)：550 ℃；氣簾氣(CUR)：241 325 Pa；輔助氣(GS2)：341 750 Pa；碰撞氣(CAD)：48 265 Pa；化合物的射入電壓(EP)和碰撞室射出電壓(CXP)，在正離子模式時為10 V和17 V，負離子模式時為-10 V和-17 V。經過優化的所有分析物的其他參數，包括定量與定性離子對、去簇電壓(DP)及碰撞能量(CE)，見表1。儀器控制、數據采集和處理使用Analyst 1.6.3和SCIEX OS 1.5軟件進行。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

查閱文獻獲知化合物的分子式，在電噴霧離子源正負離子模式下，先用針泵進樣各目標化合物的單個標準溶液，使用Q1 Scan確定母離子的質荷比；使用Product Ion Scan設定CE初始值為5 eV，以5 eV為步長自動調節CE，得到至少2～3個響應值高的特征子離子的質荷比；根據選出的母、子離子，組建定量與定性MRM離子對，優化CE和DP，以得到的參數初步建立MRM方法[16]。優化結果見表1。

2.2 流動相的優化

圖1 115種農藥的提取離子流色譜圖(10 ng/mL)Fig.1 Extracted ion chromatogram of 115 pesticides(10 ng/mL)

選用甲醇作為有機相B，比較了在有機相和水相中不加鹽與同時加入2、5、10 mmol/L甲酸銨時，各目標化合物的峰值響應情況，結果表明，當流動相中加入5 mmol/L甲酸銨時，所有目標農藥在靈敏度、峰形和分離度等方面的綜合情況較好，故確定流動相中加入甲酸銨的濃度為5 mmol/L。考察了流動相在不加酸，以及加入體積比為0.01%、0.05%、0.1%甲酸的情況下，待測農藥的峰值響應情況。結果表明，當流動相中不加酸時，各待測農藥在靈敏度、峰形和分離度等方面的綜合情況較好，因而最終選用含5 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液-含5 mmol/L甲酸銨的水溶液體系作為流動相。以此流動相體系運行MRM方法，確定各待測農藥的保留時間，建立Scheduled MRM方法，分時間窗口進行數據采集，以提高檢測效率和靈敏度[17]。115種農藥的提取離子流圖如圖1所示。

2.3 前處理方法的優化

提取各類基質中的農藥常采用的前處理方法包括：沉淀蛋白法、液液萃取、固相萃取、分散固相微萃取、低共熔溶劑萃取以及QuEChERS前處理方法等[18-19]。本研究考慮到實際工作中快速高效的分析要求，考察了操作較為簡便的固相萃取和有機溶劑沉淀蛋白前處理方法。固相萃取采用HLB固相萃取小柱，分別考察了甲醇和乙酸乙酯作為洗脫劑時的提取效果。結果表明，HLB固相萃取法提取血液中的目標農藥效果較差，部分農藥不能有效提取。沉淀蛋白法考察了甲醇和乙腈兩種常用沉淀劑提取效果的差異，并研究了沉淀劑用量對回收率的影響[16]。在農藥添加水平為10 ng/mL時，考察了樣品與沉淀劑的體積比分別為1∶2、1∶3、1∶5、1∶10時的加標回收率，以空白基質匹配農藥標準溶液做回收實驗。結果表明，當樣品與沉淀劑體積比為1∶2和1∶3時，乙腈的沉淀效果雖明顯優于甲醇，但仍有部分目標農藥的回收率未達到預期范圍。當樣品與沉淀劑的體積比為1∶5和1∶10時，兩種沉淀劑的提取效果和回收率無明顯差異，其中甲醇作為萃取溶劑，樣品與沉淀劑體積比為1∶5時，目標農藥的加標回收率較好(80%～110%)，且由于甲醇毒性較乙腈低，因而最終確定以甲醇作為沉淀劑，樣品與沉淀劑體積比為1∶5的方法沉淀蛋白。

2.4 基質效應

用空白基質配制的標準溶液中目標農藥的峰面積(A)與溶劑配制的標準溶液中目標農藥峰面積(B)的比值來考察方法的基質效應(ME)，ME=A/B×100%。當ME<100%時，說明基質對目標物有抑制作用，當ME>100%時，則存在基質增強效應[20]。分別計算農藥添加質量濃度為10、50、100 ng/mL時的基質效應。根據實驗結果，所有目標農藥的基質效應為81.8%～115%。定量分析時應考慮基質效應的影響，以確保方法的準確性和可靠性[21]。

2.5 線性關系、檢出限與定量下限

在空白血液中分別添加0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的混合農藥標準品，按照優化的實驗條件進行測定，以目標物的質量濃度(x，ng/mL)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸。結果表明，115種農藥在1～200 ng/mL范圍內線性關系良好(r>0.99)，87%目標農藥的檢出限(LOD，S/N≥ 3)達到0.1 ng/mL，13%為0.2 ng/mL，115種農藥的定量下限(LOQ，S/N≥ 10)均為1 ng/mL。說明該方法具有較高的靈敏度，可以滿足農藥殘留測定的要求[22]。

2.6 回收率及日內、日間相對標準偏差

分別在10、50、100 ng/mL 3個濃度水平下對空白血液樣品進行加標回收實驗，每個濃度水平在1天內重復進樣6次，計算相對標準偏差(RSD)，得到日內精密度(Intra-RSD)；連續進樣3天，計算日間精密度(Inter-RSD)。相關數據顯示，115種農藥的回收率為80.4%～109%，日內精密度為1.6%～11%(見表1)，日間精密度為1.9%～13%。說明該方法的重復性和準確性良好，證明了其在多農藥分析中的可靠性和實用性。

表1 115種農藥的保留時間(RT)、質譜參數、回收率及相對標準偏差Table 1 Retention times(RT),MS parameters,recoveries and RSDs for 115 pesticides

(續表1)

(續表1)

2.7 實際案例應用

2019年9月,甘肅省某男子在家中用餐后中毒死亡，經調查其妻子在該名男子所喝菜湯中加入了農藥，農藥來自于一標有“氯氰菊酯”字樣的塑料瓶，瓶內農藥已被倒光。送檢檢材包括塑料瓶的甲醇提取液約5 mL,死者血液樣品約3 mL。取10 μL塑料瓶提取液用甲醇逐級稀釋1 000倍進行分析，檢出高濃度的敵敵畏、毒死蜱和氯氰菊酯。取死者血液樣品200 μL按照本研究所建立的方法進行分析，檢出敵敵畏189.04 ng/mL，tR=4.93 min，定量離子對220.9/109.0(m/z)；毒死蜱171.32 ng/mL，tR=11.79 min，定量離子對349.9/197.9(m/z)；氯氰菊酯106.50 ng/mL，tR=12.73 min，定量離子對433.1/191.0(m/z)，其色譜圖見圖2。剩余檢材進行密封避光冷凍保存。實驗結果表明該方法可應用于實際案例的檢測。

圖2 3種農藥的色譜圖Fig.2 Chromatograms of three pesticides

3 結 論

本文建立了超高效液相色譜-串聯質譜同時測定血液中115種農藥的方法。該方法簡便快速、靈敏度高、穩定性好，滿足了實際工作中一針進樣同時對百種農藥進行定性定量分析的需求，為法醫毒理學生物基質中多農藥的檢驗鑒定提供了高效可靠的途徑。