宮頸癌患者治療前后Tie-2和Ang-2的表達水平及其對預后的預測價值

任瑩　叢玲華　何喻　方來福

[摘要] 目的 探討宮頸癌患者治療前后Tie-2和Ang-2的表達水平及其對預后的預測價值。 方法 對2015年1月～2016年5月我院診治的72例宮頸癌患者回顧性分析，并選擇同時期、同年齡段的體檢人群110例作為對照組，比較宮頸癌患者治療前后Tie-2和Ang-2的表達水平，分析死亡與生存患者臨床資料間的差異，應用多因素Cox回歸模型探究影響宮頸癌患者預后的獨立危險因素，并應用受試者工作特征曲線評估對預后的預測價值。結果 宮頸癌患者治療前血清與組織Tie-2（P=0.000）的表達水平均顯著高于對照組，宮頸癌患者治療前血清Ang-2水平顯著高于對照組（P=0.000）;治療后，宮頸癌患者的血清Tie-2和Ang-2的表達水平顯著低于治療前（P=0.000， 0.002）。在為期24個月的隨訪中，共發生全因死亡31例，死亡組的臨床分期（P=0.000）、治療后血清Ang-2（P=0.000）和Tie-2水平（P=0.049）明顯高于生存組。多因素Cox回歸分析顯示，治療后Ang-2水平是影響宮頸癌患者預后的獨立危險因素（P=0.000），臨床分期Ⅱ期是宮頸癌患者預后的獨立保護因素（P=0.006）。治療后血清Ang-2水平預測宮頸癌患者預后的AUC明顯高于臨床分期和Tie-2（P=0.000），其最佳截點為≥1.22 ng/mL，敏感性和特異性分別為87.10%和92.68%。 結論 宮頸癌患者Tie-2和Ang-2的血清和組織表達水平較高，治療后血清Ang-2水平是影響預后的獨立危險因素，并對預后具有較高的預測價值。

[關鍵詞] 血管生成素-2;Tie-2;宮頸癌;表達;預后

[中圖分類號] R737.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）07-0006-05

Expression levels of Tie-2 and Ang-2 in patients with cervical cancer before and after treatment and their predictive value for prognosis

REN Ying? ?CONG Linghua? ?HE Yu? ?FANG Laifu

Department of Pathology， Yinzhou People's Hospital of Ningbo City， Ningbo? ?315040， China

[Abstract] Objective To explore the expression levels of Tie-2 and Ang-2 in the patients with cervical cancer before and after treatment and their predictive value for prognosis. Methods Seventy-two patients with cervical cancer treated in our hospital from January 2015 to May 2016 were analyzed retrospectively， and 110 people of the same age receiving healthy checkup in the same period were selected as controls. The expression levels of Tie-2 and Ang-2 in the patients with cervical cancer before and after treatment were compared， and the differences in clinical date between the death and the survival patients were analyzed. The multivariate Cox regression model was applied to test the independent risk factors affecting the prognosis of patients with cervical cancer， and the receiver operating characteristic curve was applied to evaluate the predictive value for prognosis. Results The serum and tissue expression levels of Tie-2 （P=0.000） in? the patients with cervical cancer before treatment were significantly higher than those in the control group， and the serum Ang-2 level of the patients with cervical cancer before treatment was significantly higher than that in the control group（P=0.000）. The serum expression levels of Tie-2 and Ang-2 in the patients with cervical cancer after treatment were significantly decreased compared with those before treatment（P=0.000， 0.002）. During the 24-month follow-up， 31 all-cause deaths were detected. The clinical stage（P=0.000）， and post-treatment serum Ang-2 （P=0.000） and Tie-2（P=0.049） levels in the death group were significantly higher than those in the survival group. It was found by Multivariate Cox regression analysis that the Ang-2 level was an independent risk factor for the prognosis of the patients with cervical cancer after treatment（P=0.000） and that the clinical stage II was an independent protective factor for the prognosis of the patients with cervical cancer（P=0.006）. The AUC of the Ang-2 level predicting the prognosis of the patients with cervical cancer was significantly higher than that of the clinical stage and Tie-2 after treatment（P=0.000）， of which the optimal cut-off point was ≥1.22 ng/mL， and the sensitivity and specificity were 87.10% and 92.68%， respectively. Conclusion The serum and tissue expression levels of Tie-2 and Ang-2 in the patients with cervical cancer are relatively high. The serum Ang-2 level after treatment is an independent risk factor for prognosis and has a high predictive value for prognosis.

[Key words] Ang-2; Tie-2; Cervical cancer; Expression; Prognosis

宮頸癌是常見的女性生殖系統腫瘤，且隨著性開放和社會發展，我國宮頸癌的發病率較以往明顯升高。早期宮頸癌表現多不典型，患者就診和確診時多已失去手術指征，因而具有較高的病死率（每年全世界有26萬人死于宮頸癌）[1]。新生血管的生成是腫瘤發生、發展和轉移的主要機制之一，也是影響患者預后的重要因素，其中，影響血管生成的相關因子是目前腫瘤早期診斷、治療和預后評估的研究熱點[2]。研究發現，血管生成素-2（Angiogenin，Ang-2）及其酪氨酸受體Tie-2參與了血管生成和血管重塑過程，且在不同病情的宮頸癌患者中有不同表達水平，可能與治療療效和預后有一定的相關性[3]，但對于患者遠期預后的預測價值尚不十分明確。為此，我院對72例宮頸癌患者進行了一項回顧性研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年1月～2016年5月我院診治的宮頸癌患者，納入標準：①臨床及病理檢查符合《宮頸癌診斷與治療指南（第4版）》[4]中宮頸癌的診斷;②預后分期Ⅱ～Ⅳ期;③均于我院行宮頸癌根治術治療及術后輔助化療;④新發患者，無前期治療干擾。排除標準：①無法耐受相關治療而中途終止治療的患者;②患者依從性較差，無法配合隨訪工作者。共納入72例患者，年齡31～66歲，平均（53.13±4.09）歲，Ⅱ期18例，Ⅲ期41例，Ⅳ期13例;此外，選擇110例經病理學檢測排除惡性腫瘤的健康體檢患者，兩組患者的一般資料比較無統計學差異（P>0.05）。見表1。

1.2 治療方案

根據《宮頸癌及癌前病變規范化診療指南》[5]，預后分期為Ⅱ～Ⅳ的宮頸癌患者均推薦行術后輔助化療。其中，臨床Ⅱ期患者行單純FU類藥物化療;臨床Ⅲ期實施以5-FU為基礎聯合鉑類的方案化療，Ⅳ期患者實施以5-FU聯合鉑類化療聯合治療。

1.3 免疫組化檢查

1.3.1 組織芯片制備? 由高年資病理醫師重判每例的HE切片，在相應癌組織和周圍正常組織各取3個區域，取樣針直徑1.5 mm，設計7×8點陣，共56位點，組織芯間距3.0 mm。52℃恒溫烤箱融蠟，4℃冰箱存放備用。

1.3.2 免疫組化檢查? 采用組織芯片系統（Quick-Ray，UT06，UNITMA，Korea）進行分析。組織芯片切片經二甲苯脫蠟、乙醇脫二甲苯、水化。加熱pH6.0檸檬酸緩沖液至98℃并行抗原修復12 min后分別滴加一抗Tie-2（ab13585，美國Abcam）和Ang-2抗體（ab78106， Abcam，美國Abcam），二抗為通用型IgG抗體-HRP多聚體，室溫或37℃孵育30 min。染色情況由2名高年資病理醫師分別評估，表達量值由X-tile軟件程序（Rimm Lab，Yale University，New Haven，CT，USA）進行定量測量。

1.3.3 血清學檢查? 分別于治療前和治療完成后抽患者的靜脈血樣3 mL，離心后取血清待測。將患者的血清樣本統一標號，使用Ang-和Tie-2相應酶聯免疫吸附法試劑盒（日本IBL生產，購自深圳科潤達生物）及配套試劑，根據說明操作，將標準樣品和測試樣品使用自動酶標儀（雷杜RT-500）進行定量測定。

1.4 觀察指標

比較宮頸癌患者治療前后Tie-2和Ang-2的表達水平，分析預后良好與預后不佳患者臨床資料間的差異，應用多因素Cox回歸模型研究影響宮頸癌患者預后的獨立危險因素，并應用受試者工作特征曲線評估對預后的預測價值。

1.5 隨訪

根據病案信息每2個月對患者進行一次隨訪，終點事件為全因死亡。隨訪時間為24個月，隨訪截止于2018年6月1日。預后不及定義為在隨訪期間死亡。

1.6 統計學方法

數據處理采用SPSS 25.0軟件，計數資料以[n（%）]表示，分類變量的組間比較采用χ2檢驗，等級變量采用秩和檢驗;計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析，兩組比較采用SNK法。多因素Cox回歸分析探究危險因素，并采用Logrank檢驗計算風險比（Hazard ratio，HR）。當P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組和宮頸癌患者血清與組織Tie-2和Ang-2的表達水平比較

宮頸癌患者治療前血清與組織Tie-2（t=9.288， 23.737，P=0.000）的表達水平均顯著高于對照組，宮頸癌患者治療前血清與組織Ang-2水平顯著高于對照組（t=22.882、25.476，P=0.000）;治療后，宮頸癌患者的血清Tie-2和Ang-2的表達水平顯著低于治療前（t=14.988、3.497，P=0.000、0.002），見表2。手術和放化療后完全緩解的患者找不到病灶，故而無法取樣和檢測，因此未比較治療后組織Ang-2和Tie-2表達水平。

2.2 宮頸癌不同預后患者的臨床資料比較

在為期24個月的隨訪中，共發生全因死亡31例，死亡組的臨床分期（Z=4.027，P=0.000）、治療后血清Ang-2（t=3.820，P=0.000）和Tie-2水平（t=2.030，P=0.049）明顯高于生存組。見表3。

2.3 影響宮頸癌患者預后的多因素Cox回歸分析

多因素Cox回歸分析顯示，治療后Ang-2水平是影響宮頸癌患者預后的獨立危險因素（HR=28.959，P=0.000），臨床分期Ⅱ期是宮頸癌患者預后的獨立保護因素（HR=0.174，P=0.006）。見表4。

2.4 不同指標預測宮頸癌患者預后的ROC曲線

應用治療后血清Ang-2水平預測宮頸癌患者預后的AUC明顯高于臨床分期和Tie-2（Z=4.282，5.062， P=0.000，0.000），其最佳截點為≥1.22 ng/mL，敏感性和特異性分別為87.10%和92.68%，見圖1、表5。

3 討論

全球宮頸癌的發病率從1980年的37.8萬例/年增加到2012年的52.8萬例/年，我國是宮頸癌高發地區之一[6]。盡管基于宮頸細胞學和HPV檢測的宮頸篩查方案可以有效降低宮頸癌的發病率，但由于患者社會、宗教和心理因素的影響，我國高危女性接受標準化篩查的比例還較低，導致較大比例的宮頸癌患者就診時已出現周圍或遠處轉移，生存情況和生活質量均較低[7]。血管的生成對腫瘤進展至關重要，血管生成相關的標志物在多種腫瘤中的高表達及其作用通路得到了大量研究證實[8]，并已顯示出作為治療中晚期的治療靶標的巨大前景[9]。

人Ang及其受體Tie系統主要由三種分泌型配體（Ang-1、Ang-2和Ang-4）和兩種酪氨酸激酶受體（Tie-1和Tie-2）組成[10]，以上三種Ang可以直接與Tie-2結合并導致Tie-2的磷酸化和多聚化，從而引發下游信號傳導并調節血管重塑和成熟[11]。Ang-1和Ang-4廣泛表達于人類靜息脈管系統的內皮細胞，具有維持血管成熟和穩定的作用;而Ang-2在血管重塑和血管生成期間在內皮細胞中表達，并介導血管的重塑和外向型生長[12]。

本研究通過對72例宮頸癌患者及110例對照組宮頸組織和血清Ang-2與Tie-表達2水平進行分析，結果顯示，與對照組相比，宮頸癌患者在治療前后的組織和血清Ang-2與Tie-2水平明顯升高，這顯示，宮頸癌患者的腫瘤組織及外周血中存在較高的Ang-2與Tie-2表達。腫瘤的血管生成不僅涉及既往存在的血管生長，也與新生血管的出現等生理過程密切相關，這其中，血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和Ang-2等在內的影響血管生成的調節因素起到了重要作用[13]。目前基于VEGF的相關機制已有大量研究證實，其相關生物制劑也在臨床治療中得到了一定應用。與VEGF促進原有血管內皮生長的作用不同，血管生成素（Ang）家族在血管形成、成熟、修復和通透性的調節中均起到了重要作用，并且與癌細胞侵襲和轉移密切相關[14]。作為Ang家族中作用效果最強的Ang-2，具有極強的破壞原有血管結構并增強內皮細胞對VEGF敏感性的作用[15]。還有研究顯示，除了VEGF和Ang-2的共同表達促進了新的血管產生之外，Ang-2還可以在不依賴VEGF的條件下促進血管內皮細胞的遷移和增殖，從而促進血管重塑以及轉移區域血管生成[16]，這一作用被認為與Ang-2與其血管內皮特異性酪氨酸受體Tie-2有關[17]。

而本研究還顯示，治療后宮頸癌患者的血清Ang-2與Tie-2表達水平均出現了顯著下降，但仍高于對照組，可見手術聯合化療治療可以較為明顯地降低患者Ang-2及其受體Tie-2的表達水平，但患者治療后仍有一定程度的高表達狀態，這可能是患者發生遠期轉移和預后不良的重要因素。

通過對治療后患者進行為期24個月的隨訪，共發生死亡事件31例，而對比死亡組與生存組患者的相關臨床資料，結果顯示，死亡組具有更高的臨床分期和治療后血清Ang-2水平，且多因素Cox回歸分析顯示，治療后血清Ang-2水平是預后的獨立危險因素，而Ⅱ期患者的預后明顯優于其他患者。分析與Tie-2相比，Ang-2與治療后預后具有更高的相關性的原因，可能與Ang-1/Ang-2表達平衡失調[18]，以及Ang-2可以通過與內皮細胞、間充質細胞和腫瘤細胞上的整聯蛋白直接作用而發揮Tie-2非依賴性生物學效應有關[19]。

盡管目前宮頸癌相關手術和化療研究已取得一定進展，但對于患者治療后的預后評估尚無較好的定量指標。本研究通過應用ROC曲線對不同指標預測宮頸癌患者治療后的生存情況進行分析，結果顯示，治療后血清Ang-2水平預測宮頸癌患者預后的AUC明顯高于臨床分期和Tie-2，以最佳截點（≥1.22 ng/mL）預測患者2年生存的敏感性和特異性分別為87.10%和92.68%。臨床研究表明，腫瘤血管密度與各種實體瘤患者的不良預后之間存在直接相關性，而治療后仍高表達的Ang-2可以加速新生血管生成，并促進殘留腫瘤組織的生長、擴散和遠處轉移，這也為應用治療后Ang-2水平預測預后提供了理論依據。這與Li P等[20]應用血清Ang-2水平預測乳腺癌患者預后的研究結論較為一致，而Diaz-Sanchez A等[21]使用血清Ang-2水平預測肝癌的侵襲力的研究也取得了較好的效果。

綜上所述，宮頸癌患者Tie-2和Ang-2的血清和組織表達水平較高，治療后血清Ang-2水平是影響宮頸癌患者預后的獨立危險因素，并對患者的預后具有較高的預測價值。

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（收稿日期：2019-07-29）