工程大腸桿菌高效轉化外源脂肪酸生成羥基脂肪酸的研究

王相偉

摘要：細胞色素P450單加氧酶（P450BM3）能特異性催化脂肪酸ω碳位羥基化反應生成羥基脂肪酸，在前期構建攜帶單加氧酶基因P450BM3工程大腸桿菌（Escherichia coli）轉化脂肪酸的基礎上，為解決外源脂肪酸在羥基化過程中的消耗和轉運問題，構建了脂酰基輔酶A合成酶基因（fadD）缺失和外膜蛋白編碼基因（fadL）過表達的工程菌株。搖瓶條件下羥基十二酸產量達到748.8 mg/L，轉化率為93.6%。

關鍵詞：脂酰輔酶A合成酶;外膜蛋白編碼基因;羥基脂肪酸;重組大腸桿菌（Escherichia coli）

中圖分類號：TS206.4 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）01-0152-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.035 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Cytochrome P450BM3 can hydroxylates fatty acids into hydroxyfatty acids（HFAs） at the ω-positions with high entioselectivity. Based on the construction of Escherichia coli carrying P450BM3 gene to transform fatty acids. As an effort to solve inhibit fatty acid β-oxidation and increase outer membrane fatty acids transporter， the lipoacyl-coa synthase gene（fadD） deletion and outer membrane proteins encode gene（fadL） overexpression strains were built. Under shake-flask conditions， this recombinant strains produced 748.8 mg/L hydroxy dodecanoic acid， meanwhile the conversion rate was 93.6%.

Key words： lipoacyl-coa synthase gene（fadD）; outer membrane proteins encode gene（fadL）; hydroxy fatty acid; recombinant Escherichia coli

羥基脂肪酸是合成假神經酰胺、聚酯以及內酯的重要前體[1-3]，其中，ω-羥基脂肪酸由于羥基位于首位碳鏈端，可為聚合物材料合成提供最長碳鏈，是生物可降解材料研究開發中最理想的原料之一[4-6]。由于傳統化學合成的局限性，微生物合成羥基脂肪酸已成為近年來的研究熱點[7]。

微生物轉化脂肪酸合成羥基脂肪酸具有轉化效率低的特點[8]，為提高外源脂肪酸轉化率和羥基脂肪酸產量，引入增加胞外脂肪酸轉運量和降低菌體β氧化途徑的策略，通過敲除脂酰基輔酶A合成酶基因（fadD）阻斷脂肪酸β氧化途徑[9，10]，以增加底物脂肪酸濃度;過表達大腸桿菌（Escherichia coli）外膜蛋白編碼基因（fadL），增大外源脂肪酸轉運量[11，12]。通過對重組菌發酵條件的優化，有效提高了外源脂肪酸轉化率和ω-羥基脂肪酸產量。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌株、質粒和引物 ?Escherichia coli BL21 （DE3）和Escherichia coli DH5α，Invitrogen公司;菌株Bacillus megaterium 14581、Escherichia coli K-12、質粒pET-28a（+）和pACYCDuet-1，Novagen公司。

工程菌Escherichia coli BL21（DE3）+pACYCDuet-1-P450BM3記作WX1;Escherichia coli BL21（DE3）△fadD+pACYCDuet-1-P450BM3，記作WX2;Escherichia coli BL21（DE3）△fadD+pACYCDuet-1-P450BM3+pET-28a（+）-fadL，記作WX3。3種工程菌株由山東大學（威海）海洋學院實驗室構建并保藏。菌株WX1攜帶質粒pACYCDuet-1，質粒上攜有脂肪酸羥化酶基因P450BM3，菌株WX2、WX3為fadD基因敲除型，質粒pET-28a（+）攜帶fadL基因。本研究所用菌株、質粒及引物見表1。

1.1.2 ?試劑與培養基 ?Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTP、感受態細胞，Takara公司;限制性內切酶及膠回收試劑盒，質粒提取試劑盒等，生工生物工程（上海）股份有限公司;十二酸（月桂酸）、10-羥基癸酸、卡那霉素、氯霉素、胰蛋白胨、酵母提取物及IPTG等，中國醫藥集團有限公司。其余試劑均為國產分析純。

LB液體培養基（g/L）：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0。

M9發酵培養基（g/L）：葡萄糖20，磷酸氫二鈉6，磷酸二氫鉀3，氯化銨1，氯化鈉0.5，硫酸鎂0.12。

1.1.3 ?儀器與設備 ?Aglient 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀，Aglient Technologies公司;LDZM-80KCS型蒸氣滅菌器，馳通儀器（上海）有限公司;ZHWY-1102B恒溫搖床，上海申安醫療器械廠;Neofuge15R型冷凍離心機，力新儀器（上海）有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?發酵條件 ?構建的工程菌株以1∶100的比例轉接至500 mL M9培養基搖瓶中，菌株WX1和WX2培養時加入終濃度34 mg/L氯霉素，菌株WX3添加終濃度34 mg/L氯霉素和50 mg/L卡那霉素。恒溫搖床振蕩培養至菌體OD600 nm為2.0，加入IPTG（0.1 mmol/L）誘導基因表達，為增加蛋白表達活性，培養溫度降為30 ℃，以利于蛋白表達[13]。在菌體培養至指數后期，菌體用0.2 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.4）配成菌懸液，添加葡萄糖（0.5%）和脂肪酸進行全細胞催化反應。

1.2.2 ?代謝產物處理與分析 ?產物處理及檢測參考文獻[14]，離心收集發酵液上清，6 mol/L鹽酸調節pH至2.0，利用等體積氯仿抽提，抽提液加入甲酯化試劑（H2SO4/CH3OH）于60 ℃水浴酯化反應20 min后，等體積正己烷萃取。利用Aglient 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀對產物進行定量和定性，以10-羥基癸酸為內標進行定量。

轉化率=ω-羥基脂肪酸產量/外源脂肪酸添加量×100%

代謝產物分析色譜條件為HP-5毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）;升溫程序為起始80 ℃，持續2 min，5 ℃/min升溫至250 ℃，保持10 min。加樣器和檢測器溫度分別為250 ℃和300 ℃。

質譜條件為電子轟擊（EI）離子源，離子能量70 eV，離子源溫度220 ℃;掃描模式為全掃描;質量掃描范圍m/z為10～600。

2 ?結果與分析

2.1 ?fadD基因缺失對羥基脂肪酸產量的影響

大腸桿菌脂肪酸β氧化途徑過程會消耗脂肪酸[15]，因此在羥基脂肪酸的合成途徑中敲除脂酰基輔酶A合成酶基因，可以減少羥化底物的消耗，增加羥基脂肪酸產量。在P450單加氧酶（P450BM3）成功表達的基礎上，為驗證fadD基因缺失對羥基脂肪酸產量的促進作用，分別將重組菌WX1和WX2接種至M9基本培養基中，添加1 mmol/L十二酸測定細胞羥基脂肪酸產量的變化情況。搖瓶試驗結果表明，菌株WX2發酵后羥基十二酸產量為163.8 mg/L（轉化率81.9%），是對照菌株WX1產量的1.9倍（圖1）。表明在Escherichia coli中敲除脂酰基輔酶A合成酶后，對羥基脂肪酸產量有了明顯的促進作用，提高了Escherichia coli羥基脂肪酸合成能力。

2.2 ?fadD基因缺失和fadL基因過表達對羥基脂肪酸產量的影響

為進一步驗證fadL基因過表達對羥基脂肪酸產量的影響，分別將重組菌WX2和WX3接種至M9基本培養基中，添加1 mmol/L十二酸測定HFAs的產量。在搖瓶條件下，經GC檢測，菌株WX3發酵后羥基十二酸產量為189.4 mg/L（轉化率94.7%），是WX2菌株產量的1.2倍（圖1）。表明在Escherichia coli中過表達大腸桿菌fadL基因，有利于提高脂肪酸轉化率和菌株羥基脂肪酸產量，是提高Escherichia coli羥基脂肪酸合成能力的有效途徑。

2.3 ?底物十二酸濃度對羥基脂肪酸產量和轉化率的影響

為更進一步提高羥基脂肪酸（HFAs）產量，對底物十二酸不同濃度進行了研究，在濃度為1～5 mmol/L，菌株WX3濃度為1～4 mmol/L時產量隨濃度增加而增加，底物轉化率維持在較高的水平（>90%），在4.0 mmol/L時羥基十二酸產量達到最大值748.8 mg/L（轉化率93.6%）（圖2）。然而隨著底物濃度增大，羥基脂肪酸產量和底物轉化率降低，在濃度為5 mmol/L時產量僅為529.9 mg/L（轉化率26.8%），原因可能是隨底物脂肪酸濃度增大引起酶失活或對細胞有毒害作用[16]，導致羥基脂肪酸產量和底物轉化率的降低。

2.4 ?fadD基因缺失和fadL基因過表達對羥基脂肪酸組成的影響

通過GC-MS方法對菌株WX1和WX3產物組成進行定量分析，結果如圖3所示。工程菌株WX1和WX3產物均含有3種羥基脂肪酸，分別為ω-1羥基十二酸、ω-2羥基十二酸和ω-3羥基十二酸。其中，ω-1羥基十二酸在兩種工程菌種產物中所占比例最高，在40.7%～43.7%，無明顯差異。產物ω-2羥基十二酸和ω-3羥基十二酸所占比例差別不大，分別為31.1%、28.3%和27.5%、28.8%。表明fadD基因缺失和fadL基因過量表達僅影響羥基脂肪酸產量而不影響其種類和組成。

3 ?小結與討論

研究的目的是構建能高效轉化外源脂肪酸生成羥基脂肪酸的菌株，在試驗中構建了敲除大腸桿菌脂酰基輔酶A合成酶基因和過表達外膜蛋白編碼基因的菌株以提高羥基脂肪酸的產量，經發酵條件優化后，基因工程菌株WX3羥基十二酸產量為189.4 mg/L，轉化率為94.7%，相比原始菌株產量（82.4 mg/L）和轉化率（41.2%）均有較大的提高。增加底物濃度至4 mmol/L，羥基十二酸產量達748.8 mg/L（轉化率93.6%），代表了生物轉化脂肪酸生成羥基脂肪酸的一個較高水平。在今后的研究中，通過尋找反應性更強的羥化酶以及對大腸桿菌進行進一步代謝工程改造，羥基脂肪酸產量有望得到進一步的改善和提高。

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