四川部分地區奶牛源無乳鏈球菌的分離鑒定、毒力基因檢測及耐藥性分析

張保海，羅梓丹,蘆 彪,姚學萍,王 印,2,楊澤曉,羅 燕,曹隨忠

(1.四川農業大學 動物醫學院，成都 611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130)

奶牛乳房炎是奶牛養殖場的常見疾病，也是嚴重阻礙奶牛養殖場經濟效益，制約奶牛養殖業發展的重要因素[1]。引起奶牛乳房炎的病原菌多達80余種，其中無乳鏈球菌是一種較為常見的條件性致病菌，該菌可引起臨床型奶牛乳房炎，導致奶牛體細胞數升高，免疫力降低，甚至進入牛奶中的無乳鏈球菌可能危害人類健康[2-4]。此外，該菌若感染孕婦，可引起孕婦早產、流產及胎兒發育不良等，若發生垂直傳播則可導致新生兒腦膜炎、肺炎和敗血癥等；該菌還可感染魚類，引發大面積的死亡[5-6]。

本研究針對2017—2019年采集的四川部分地區奶牛臨床型乳房炎乳樣，運用傳統方法和分子生物學方法進行細菌分離鑒定，并對分離到的無乳鏈球菌進行莢膜分型、藥物敏感試驗、毒力基因和耐藥基因檢測，以期為四川部分地區奶牛乳房炎的防控、流行病學調查以及相關疫苗的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣按照NY/T 2962-2016標準進行，2017- 2019年從四川青白江、邛崍、洪雅、安岳、綿陽及周邊地區奶牛養殖場采集臨床型乳房炎乳樣共計313份，樣品在低溫狀態下于24 h內送至實驗室做細菌培養。

1.2 主要試劑

哥倫比亞血瓊脂基礎培養基、脫纖維綿羊血均購于北京奧博星生物技術有限公司；MH瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆肉湯購于青島海博生物技術有限公司；細菌DNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司；藥敏紙片、生化鑒定管均購于杭州微生物試劑有限公司；2×TaqMaster Mix、DL2000 DNA marker、瓊脂糖均購于成都擎科生物技術有限公司，Goldview核酸染色劑購于北京索萊寶科技有限公司，其他試劑為國產分析純。

1.3 細菌分離培養

將采集的乳樣用無菌棉簽拭子接種到體積分數5%綿羊血的哥倫比亞血瓊脂培養基，37 ℃培養18～24 h后，對疑似菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，并進一步純化，挑取純培養物于體積分數5%血清的 TSB 培養基中，37 ℃恒溫振蕩儀過夜 培養。

1.4 生化鑒定

無菌挑取細菌純培養物，參照鏈球菌生化鑒定手冊進行海藻糖、山梨醇、馬尿酸鈉、七葉苷和VP生化鑒定，并進行CAMP和觸酶試驗。

1.5 16S rDNA鑒定

按照天根細菌組DNA提取試劑盒操作說明，用“1.3”的細菌增菌液提取細菌DNA。參照文獻[7]合成細菌16S rDNA通用引物，引物序列為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′，1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由擎科生物技術有限公司合成，反應總體系為25 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1.5 μL，ddH2O補足體系。PCR反應程序為95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃延伸45 s，34個循環；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR產物經12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，16S rDNA 基因預期擴增片段約1 500 bp。將擴增產物送至華大(北京)基因股份有限公司測序，并在NCBI上在線比對。

1.6 莢膜分型

根據Imperi等[8]建立的多重PCR莢膜分型方法，合成相關引物，并按照其推薦的PCR體系及反應程序進行多重PCR，PCR產物電泳后，根據出現的條帶大小及數量判定無乳鏈球菌的莢膜類型。

1.7 藥敏試驗

選取β-內酰胺類藥物(哌拉西林、頭孢曲松、青霉素、阿莫西林、頭孢他啶)和氨基糖苷類藥物(卡那霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素、妥布霉素)共計10種抗生素，采用CLSI[9]推薦的瓊脂擴散法(K-B)進行藥物敏感試驗。

1.8 耐藥基因檢測

參照文獻[10-12]和GenBank已公布的序列，運用DNAMAN和Oligo軟件設計、合成擴增β-內酰胺類耐藥基因(TEM、OXA、IMP、DHA)和氨基糖苷類耐藥基因[aph(3′)Ia、ant(3′)I、aac(6′)Ib、aac(3′)Ib]共8對引物。PCR反應總體系為50 μL：2×TaqMaster Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，模板1.5 μL，ddH2O補足體系。PCR反應程序為95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，退火20 s，72 ℃延伸45 s，34個循環；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR產物用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化目的片段測序，相關引物序列見表1。

1.9 毒力基因檢測

參照文獻[11,13]和GenBank已公布的序列，運用DNAMAN和Oligo軟件分析后，合成擴增相關毒力因子基因的引物，檢測的毒力因子有：β-蛋白(bac)、CAMP因子(cfb)、β-溶血素(cylE)、纖維蛋白原結合蛋白(fbsA，fbsB)、透明質酸(hylB)、α-烯醇化酶(α-enolase)、黏連蛋白lmb蛋白(lmb)。PCR反應體系和程序同“1.8”，PCR產物用 8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化目的片段并測序，相關引物序列見表1。

表1 引物信息Table 1 Primers information

2 結果與分析

2.1 無乳鏈球菌分離鑒定

2.1.1 形態學特征 從313份乳樣中共分離到105株無乳鏈球菌，分離率為33.55%。觀察分離菌的培養特征，在血平板上可以看到有β溶血(或非β溶血)、淺灰色、表面光滑、圓形的小菌落(圖1-a)。顯微鏡下為藍紫色的革蘭氏陽性菌，短鏈或長鏈排列(圖1-b)。

圖1 分離細菌形態Fig.1 Isolated bacterial morphology

2.1.2 分離菌生化試驗鑒定 生化試驗結果表明，分離菌的海藻糖、馬尿酸鈉、VP和CAMP試驗結果均為陽性，山梨醇、七葉苷及觸酶試驗均為陰性，分離菌的試驗結果與無乳鏈球菌的生化反應一致。

2.1.3 16S rDNA鑒定 提取分離菌株DNA，PCR擴增16S rDNA基因，結束后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物送至華大(北京)基因股份有限公司測序。將測序結果于NCBI上在線比對，其中105株分離菌與無乳鏈球菌的相似度為99.99%。

2.2 分離菌莢膜分型

按照Imperi等[8]建立的多重PCR方法，對分離的105株無乳鏈球菌進行莢膜分型鑒定，均得到272 bp和688 bp大小的2條帶，由此判定105株分離菌莢膜類型均為Ia型(圖2)。

M.DL2000 DNA marker；1～11.分離菌株

M.DL2000 DNA marker；1-11.Isolated strain

圖2 無乳鏈球菌莢膜分型電泳圖
Fig.2 Electrophoresis map ofS.agalactiaecapsular capsule

2.3 分離菌藥敏試驗

藥敏試驗結果顯示，分離的無乳鏈球菌對氨基糖苷類藥物中的卡那霉素、慶大霉素、新霉素、妥布霉素敏感率高達100%，鏈霉素敏感率為 70.48%，還存在24.76%對鏈霉素表現耐藥；105株分離株對β-內酰胺類藥物中的青霉素、阿莫西林、頭孢他啶、頭孢曲松耐藥率高達98.10%，對哌拉西林的耐藥率為29.52%(表2)。

表2 分離的無乳鏈球菌藥敏試驗結果統計Table 2 Statistical analysis of isolated drug-resistance test results of Streptococcus agalactiae

注：R.耐藥；I.中介；S.敏感。

Note：R.Resistance; I.Intermediary; S.Sensitive.

2.4 分離菌耐藥基因檢測

對分離的105株無乳鏈球菌分別進行β-內酰胺類和氨基糖苷類抗生素共8種耐藥基因進行檢測并測序比對。結果顯示，從分離株中僅檢測到β-內酰胺類的TEM耐藥基因，檢出率為98%，其余耐藥基因均未檢測到(圖3)。

2.5 分離菌毒力基因檢測

對分離的105株無乳鏈球菌進行8種毒力基因檢測并測序比對，其中cfb、cylE、fbsA、fbsB、hylB和α-enolase基因檢出率達100%，bac和lmb基因未檢出(圖4)。

M.DL2000 DNA marker; 1～6.分離菌株

M.DL2000 DNA marker; 1-6.Isolated strain

圖3 部分分離菌耐藥基因檢測結果
Fig.3 Test results of partially isolated virulence gene

M.DL2000 DNA marker; 1～6.分離菌株

M.DL2000 DNA marker; 1-6.Isolated strain

圖4 部分分離菌毒力基因檢測結果
Fig.4 Test results of partially isolated virulence gene

3 討 論

3.1 細菌分離鑒定及莢膜分型

四川部分地區氣候濕潤，為病原微生物的生長繁殖提供了條件，導致奶牛乳房炎發病率較高。本研究采集臨床型奶牛乳房炎乳樣共計313份，經細菌分離培養、鑒定得到無乳鏈球菌共105株，分離率為33.55%。本研究主要針對臨床型乳房炎樣品分離細菌，無乳鏈球菌的分離率明顯高于杜琳等[10]報道的5.03%、張成虎等[14]報道的 17.03%，說明四川部分地區奶牛無乳鏈球菌感染較為嚴重，應加強對該菌的防控。抗生素治療是目前治療奶牛乳房炎的主要方法，但耐藥性的逐漸增強使得抗生素在治療中的作用逐步減弱，疫苗既可用于疾病的預防，還可以解決抗生素的殘留問題。莢膜多糖(Capsular polysaccharide, CPS)作為無乳鏈球菌重要的毒力因子，是設計和開發抗菌疫苗的有效靶點，目前研究結果表明，可根據CPS結構將莢膜分為10種類型(Ia，Ib，II～IX)[15]。王丹等[15]的研究結果顯示，江蘇部分地區分離的奶牛源無乳鏈球菌，其莢膜類型為II型；Rogers等[16]的研究結果顯示，從新生兒和孕婦分離的無乳鏈球菌莢膜類型主要為III型，本研究分離的無乳鏈球菌莢膜分型結果顯示為Ia型，出現這種差異可能是分離菌的地域差異和宿主源不同，這對相關疫苗的研制具有重要意義。

3.2 毒力基因

無乳鏈球菌為常見的條件性致病菌，對人、牛及水生動物均表現易感，對無乳鏈球菌致病力起促進作用的包括多種表面蛋白和內毒素，這些致病因子使無乳鏈球菌具有很強的吸附力、抗吞噬及免疫逃避能力[6]。祝宇等[12]對云南地區牛源無乳鏈球菌cfb和CAMP兩種毒力基因的檢出率分別為100%和88%，其中cfb的檢出率與本試驗一致。Carvalho-Castro等[17]對巴西奶牛源無乳鏈球菌fbsB和cfb的檢出率為100%，bac檢出率為0，與本試驗結果一致，但fbsA檢出率(42.37%)低于本研究的100%。Lmb蛋白不僅是調節細菌體內金屬穩態的關鍵，而且能識別黏連蛋白從而發揮黏附作用，但這類蛋白只存在于人源無乳鏈球菌，在牛源菌上基本不存在[18]。這些毒力因子為病原菌侵入宿主提供必要的協助，也可能直接參與對宿主的侵染過程。

3.3 耐藥性

目前，雖然已有針對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌等病原菌引起的乳房炎的相關疫苗用于奶牛乳房炎防控，但是抗生素治療仍然是首選治療方法。Zigo等[19]的研究結果顯示，23株無乳鏈球菌對苯唑西林、鏈霉素的耐藥率分別為8.7%和30.4%，對青霉素和頭孢噻呋高度敏感，與本研究結果有差異，表明中國在臨床上使用抗生素主要以β-內酰胺類藥物為主，今后可用氨基糖苷類藥物治療無乳鏈球菌引起的乳房炎。路璐等[20]的研究結果顯示，對青霉素耐藥的10株無乳鏈球菌中，β-內酰胺類耐藥基因的檢出率為100%；楊明偉等[21]的研究結果顯示，4種氨基糖苷類耐藥基因aph(3′) Ia、ant(3′)I、aac(3′)Ib和aac(6′)Ib的檢出率分別為0.0%、 75.0%、 0.0% 和31.3%。該結果與本研究結果基本一致。結合表型和耐藥基因分析，四川部分地區無乳鏈球菌對β-內酰胺類藥物有較高的耐藥性，但對氨基糖苷類藥物敏感，在今后的治療中可優先選擇氨基糖苷類藥物。

4 結 論

四川部分地區奶牛乳房炎無乳鏈球菌感染情況較為嚴重，分離菌株的莢膜類型均為 Ia 型，攜帶cfb、cylE、fbsA、fbsB、hylB和α-enolase毒力基因和介導β-內酰胺類藥物耐藥的TEM基因，且對氨基糖苷類藥物敏感，對β-內酰胺類多種藥物高度耐藥。