3D打印納米纖維/藻酸鹽基水凝膠的制備與表征

魏佳欣，洪永修，王寶秀，陳仕艷*

(1. 東華大學材料科學與工程學院，纖維材料改性國家重點實驗室，上海 201620； 2. 上海奕方農業科技股份有限公司，上海 201607)

三維(3D)打印是一種新興的生物制造方法，可在指定的3D層次組織中精準定位生物制劑，從而創建人造的多細胞組織/器官。現已經使用幾種3D打印方法成功地進行了生物打印各種組織構建體，以模仿天然組織和器官(如皮膚、軟骨、肝、肺和神經等)[1]。

組織修復用材料需要模仿細胞外基質(ECM)，從而發揮功能并促進新組織的形成，其主要成分是膠原纖維和蛋白多糖[2]。水凝膠是具有親水性交聯三維聚合物網絡的材料，因具有類似于天然細胞外基質的高水含量和理化特性而具有高度的生物相容性，適合于人造皮膚[3]、組織工程[4]、藥物遞送等生物醫用領域[2-5]，是一種有前景的生物材料。多糖之一的藻酸鹽，因其生物相容性、低成本以及易實現的交聯條件，是3D打印油墨中常見的選擇。但存在細胞粘附弱和機械性能差的問題，通常與其他生物聚合物混合進行改善。細菌纖維素(BC)是一種由木醋桿菌合成的結晶胞外多糖，由于強大的氫鍵作用和高度結晶性而具有出色的機械性能[6]。鑒于與膠原纖維的形態相似性，BC與細胞具有正相互作用，促進細胞命運過程[6-7]，并且納米纖維素的增強機理與天然組織相似。在3D打印方面，納米纖維素表現出的優異的流變行為，這有助于油墨的擠出并在打印后保持3D結構的自支撐和打印形狀[8]。

本文研究了TOBC對藻酸鹽基水凝膠的微觀形貌、壓縮、溶脹等性能的影響。通過改變TOBC和SA的比例，探索了TOBC對水凝膠油墨流變行為的影響。并以此為理論基礎，研究了水凝膠油墨流變行為與3D打印之間關系，探討加工參數對打印線條的分辨率的影響以及打印結構可控的水凝膠通孔支架的可能性，并進一步評估水凝膠的細胞相容性，為生物醫用材料領域提供新的可3D打印材料與研究基礎。

1 試 驗

1.1 試驗藥品與儀器

海藻酸鈉，分析純，國藥集團化學試劑公司；乙二胺四乙酸鈣二鈉鹽(EDTA-Ca)，分析純，國藥集團化學試劑公司；氯化鈣，分析純，國藥集團化學試劑公司；葡萄糖酸內酯(GDL)，RG,阿達瑪斯試劑公司；DMEM培養基，Hyclone公司；胰酶，Life Technologie；(CCK-8) 試劑盒，日本同仁化學研究所；LIVE/DEAD 試劑盒，上海翔升生物科技公司。TOBC和注射級超純水為實驗室自制。

美國Instron 公司Instron5969電子萬能材料試驗機，日本Hitach公司場發射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)，美國Harvard Apparatus公司Pump 11 Elite注射泵，天威PrintRite公司CoLiDo DIY 3D打印機，美國Thermo Fisher公司Nicolet 6700紅外光譜(ATR-FTIR)，瑞士Tecan公司Infinite F50酶標儀，德國Leica TCS SP5Ⅱ激光共聚焦顯微鏡。

1.2 制備過程

稱取一定量的SA溶于超純水，制備質量分數5%(%為質量分數，下同)的SA溶液。基于課題組之前的文獻[9]，制備TEMPO氧化細菌纖維素。

水凝膠油墨及樣品的制備：具體配比見表1，將一定量TOBC加入SA溶液中，并加入一定量的EDTA-Ca，進行攪拌均勻。然后加入一定量的GDL使EDTA-Ca釋放鈣離子從而預交聯8 h，存放于4℃下備用。后續在室溫下置于1%氯化鈣溶液中進行，補充交聯60 min以穩定水凝膠。

表1 樣品配方數據表

SA+TOBC是總固含量，(SA+TOBC)含量指SA與TOBC在油墨中的含量，TOBC含量是TOBC占總固含量的比例。

1.3 測試與表征

紅外光譜測試：采用ATR-FTIR分析樣品的化學結構。將樣品用超純水洗滌后進行冷凍干燥，設定波長范圍為4 000～600 cm-1，分辨率為2 cm-1。

微觀結構表征：采用FE-SEM對凍干支架的微觀形貌進行表征。

壓縮性能測試：采用萬能材料試驗機測量水凝膠壓縮性能，設定為壓縮速率10 mm/min，最大壓縮量為40%。

油墨的流變性能測試：穩態流動測試中剪切速率的測試范圍為0.01～1 000 s-1。觸變測試包括三個步驟：在步驟Ⅰ中，施加0.1 s-1的剪切速率60 s；在步驟Ⅱ中，剪切速率增加到300 s-1并保持10 s；在步驟Ⅲ中，將剪切速率降低至0.1 s-1并保持50 s。在滿足線性粘彈性區域(LVR)的臨界應時，選擇0.01%應變振幅，頻率掃描范圍為0.1～100 rad/s，得到儲能模量(G′)、損耗模量(G″)隨頻率的曲線。

3D打印測試：使用改造過的基于擠出的3D打印系統。擠出體積流量通過注射泵調節，打印速度和印刷結構等參數在G代碼中調整。除非另有說明，印刷過程在室溫下進行，使用22 G(內徑0.41 mm)圓柱形鋼尖來印刷。

細胞相容性測試：在37℃、95%濕度和5% CO2的二氧化碳細胞培養箱中培養L929成纖維細胞。待細胞傳代至所需數量時，定量地種植在水凝膠支架材料上。采用CCK-8測定細胞探究其在不同水凝膠支架上的增殖能力。采用Live/Dead染色法，直觀觀察細胞在水凝膠支架上的生長活性。通過SEM觀察細胞在水凝膠支架上的生長形貌。

2 結果與討論

2.1 水凝膠油墨的紅外光譜與微觀結構

如圖1所示，純SA水凝膠的多糖結構的特征峰出現在1 306，1 080和1 026 cm-1，對應于C-O，C-C和C-O-C伸縮振動吸收峰[10- 12]。當TOBC與SA(4ST50)混合時，大多數特征峰彼此重疊，其-COO不對稱和對稱的特征吸收峰分別為1 598 cm-1和1 424 cm-1，介于純TOBC(1 605 cm-1，1 427 cm-1)和SA(1 591 cm-1，1 417 cm-1)之間，這可能是由于TOBC的羧基與相鄰的SA分子之間形成的交聯網絡。圖2顯示了冷凍干燥的TOBC/SA復合水凝膠的SEM圖像，可以看出，水凝膠網絡是多孔的微觀結構，隨著TOBC含量的增加，孔徑越小，這可能是由于TOBC與SA側鏈的官能團之間的氫鍵相互作用使交聯密度增加的原因。

圖1 4ST0、4ST50和TOBC的FTIR譜圖

圖2 納米復合水凝膠截面形貌的FE-SEM圖(a) 4ST0; (b) 4ST30; (c) 4ST50; (d) 4ST70

2.2 水凝膠油墨的流變行為

圖3顯示了不同TOBC含量的油墨的黏度曲線，呈現出油墨的穩定以及切力變稀行為。對黏度曲線進行冪律方程的線性擬合以及公式的推導得到的數據見表2。從表中可以看出，隨著TOBC含量從0增加至30%、50%、70%，冪律指數n從0.26下降為0.22、0.17和0.15。這表明隨著TOBC含量的增加，油墨的非牛頓性越突出，對剪切速率越敏感。因此，可通過改變剪切速率來改變黏度進而加工。隨著TOBC含量從0增加至70%，噴嘴內壁的最大剪切速率從210.8 s-1依次增加至232.3、273.5和297.6 s-1。這是因為較高TOBC含量的油墨，對剪切力較為敏感，在噴嘴內壁顯示較低黏度，所以較快的被擠出，進而在噴嘴內壁的剪切速率較大。

圖3 不同TOBC含量的水凝膠油墨的黏度曲線

表2 不同TOBC含量的水凝膠油墨的與流動行為相關的擬合參數

圖4 不同TOBC含量的水凝膠油墨的觸變與恢復曲線

從表2可看出該體系油墨在噴嘴處的最大剪切速率約為200～300 s-1，故設定300 s-1為觸變實驗中高剪切速率。從圖4可看出，擠出過程中(4ST0)水凝膠油墨的初始黏度為1 050 Pa·s，當剪切速率增加到300 s-1時，黏度急劇下降到2.02 Pa·s，油墨表現得更像液體。在剪切速率突然降低至0.1 s-1后，黏度立即增加至428 Pa·s，這種觸變特性有利于擠出沉積的圖案印刷保持其形狀和結構。選擇恢復低剪切速率后30 s時的黏度恢復程度作為對比，如表2所示，隨著TOBC含量的增加至30%、50%和70%，恢復程度從41%先升高至83%，后下降到63%。由此我們可以看出，TOBC的加入明顯提高油墨的觸變行為，其中4ST50的觸變性最高，具有83%的觸變恢復率。

油墨的所得G′和G″和頻率的關系見圖5，從圖中可看出，油墨的G′和G″幾乎與頻率無關，無溶膠-凝膠轉變，表現出結構穩定性，并且G′總是大于G″，表現出類固體行為，有利于非原位打印的構建體結構的維持，為打印提供了現實的指導意義。

2.3 水凝膠油墨3D打印

圖6給出了不同TOBC含量的水凝膠油墨的細絲線寬的情況。因為純SA油墨不能連續擠出，故未進行后續打印實驗。從圖中可以看出，TOBC含量從30%增加至50%和70%，細絲線寬從(724±34)μm，降低至(622±34)μm和(546±38)μm。這說明細絲線線寬隨著TOBC含量的增加而減少。結合流變實驗，我們認為可能是TOBC增加了油墨的非牛頓行為，使其在噴嘴處的剪切細化，沉積后由于油墨的高度結構化，能維持打印形狀。隨著TOBC的含量增加，非牛頓行為和結構化程度都有所增加，故70% TOBC含量的油墨具有最小線寬。

圖6 不同TOBC含量對納米復合水凝膠油墨擠出細絲線寬的影響(比例尺:100 μm)

除了油墨組分的影響，細絲的打印連續性和線分辨率是構造3D結構的一個重要參數。打印速度即是噴嘴的移動速度Vxy對4ST50細絲線寬影響如圖7所示，隨著Vxy從3 mm/s增加至4 mm/s，細絲線寬從(834±18)μm至(632±18)μm，明顯減小。但當Vxy進一步增加至5和6 mm/s，細絲線寬變化不明顯，超過6 mm/s時，細絲就不能連續打印。這是由于噴嘴移動帶動的牽引效應，細絲將被拉伸并變得更細，細絲線寬隨著Vxy的增加而減小，但是當Vxy太高時，細絲被破壞，出現了非連續打印。結合連續印刷實驗和文獻[13]和實際打印的細絲線寬，本文采用4 mm/s的打印速度。

圖7 打印速度Vxy對細絲線寬的影響

3D生物打印的主要目標之一是打印復雜的器官或器官系統。然而，目前的生物材料缺乏機械強度以及印刷較大的中尺度結構的可印刷性。為了證明TOBC/SA復合水凝膠油墨能夠以高形狀保真度印刷復雜形狀，我們印刷了多種內外可控的結構，如高達2 cm的圓柱、耳朵、鼻子等，見圖8。

圖8 4ST50油墨印刷結構的拍攝圖(a) 圓柱；(b) 耳朵；(c) 鼻子

2.4 壓縮強度

圖9給出了不同TOBC含量的納米復合水凝膠的壓縮強度。從圖中可以看出，隨著TOBC含量從0%依次增加至30%、50%和70%，壓縮強度從(102.2±12.6)kPa增加至(125.4±12.2)kPa、(260.9±16.2)kPa、(243.4±10.6)kPa，呈現先增加后減少的趨勢。這表明適量的TOBC可提高水凝膠的壓縮強度，50%含量的TOBC使壓縮性能最優。TOBC機械增強效果顯著的主要原因在于：TOBC是一種親水性能良好的納米纖維[6]，具有高結晶度的納米纖維分布在水凝膠孔壁和內部，增加能量耗散，賦予了其較高的機械性能。此外豐富的羥基可以形成大量氫鍵，增強水凝膠的力學性能。

圖9 不同TOBC含量的納米復合水凝膠的壓縮強度

2.5 細胞增殖與活性分析

圖10給出了L929細胞在4ST0和4ST50水凝膠支架上的增殖情況。隨著培養時間的增加，細胞都表現出增殖的趨勢，并且生長狀態良好。在第1天，觀察到4ST50與4ST0增殖沒有顯著差異。在第3天，4ST50上的細胞數量顯著高于4ST0。圖11(a，b)是水凝膠支架上培養3天的細胞的Live/Dead染色圖，可發現這些支架上的活細胞緊密相聚，幾乎觀察不到死細胞。與4ST0相比，含有TOBC的4ST50上有更多的細胞并表現出鋪展的形態。圖11(c，d)給出了細胞在支架上的粘附情況和形態的SEM圖，與4ST0相比，細胞在4ST50支架上完全伸展，呈現長梭形的形態。這說明TOBC納米纖維有利于細胞粘附，進而增強細胞與支架的相互作用，促進細胞的伸展。此外，從圖11(d)可明顯看出4ST50水凝膠表面的微納米級粗糙度，有利于細胞相互作用和細胞外基質的產生，并且這種粗糙的表面有利于營養物供應和廢物去除的擴散速率，提高細胞的代謝[14]。

圖10 在不同納米復合水凝膠上L929細胞的增殖情況

圖11 Live/Dead細胞染色圖和SEM細胞形貌圖(a，b)4ST0；(c，d)4ST50

3 結 論

本文以TOBC作為增強體，制備了不同比例的TOBC/SA納米復合水凝膠材料，研究了其流變行為和3D打印的可行性，并利用3D打印的方法打印了不同形狀并具有高結構穩定性的水凝膠支架。這種能夠通過3D打印控制其內外宏觀結構以滿足組織對孔徑和外觀結構，并具有納米纖維模擬天然細胞外基質的支架材料，有望作為組織工程修復的移植物，在組織工程支架領域具有潛在的應用前景。