基于線粒體DNA標記對3個華鳈群體的遺傳結構分析

朱傳坤 潘正軍 常國亮 吳楠 王輝 丁懷宇 強曉剛 余祥勝

摘要： 華鳈（Sarcocheilichthys sinensis）是一種兼具食用和觀賞價值的小型鯉科魚類。采用Cytb和D-loop 2個線粒體DNA序列對洪澤湖、千島湖和西湖3個群體的45尾華鳈樣本進行了遺傳變異與遺傳結構分析。結果顯示，在長度為404 bp的Cytb序列中，共檢測出變異位點22個（5.4%），定義了10種單倍型;在998 bp的D-loop序列中，變異位點有40個（4.0%），構成了7種單倍型。2個標記在華鳈群體中的平均單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數分別為0.840±0.033、0.012±0.002、4.759±1.660（Cytb）和0.755±0.036、0.006±0.002、6.430±2.241（D-loop），表現了較高的遺傳多態性。遺傳多樣性大小順序為洪澤湖>西湖>千島湖，3個群體間基因交流較少，表現出極大的遺傳分化，此外，分子變異分析結果表明華鳈變異的主要來源為群體內變異。本研究結果將為了解我國東部地區華鳈的遺傳多樣性現狀提供基礎資料，同時為華鳈種質資源保護與合理利用提供參考。

關鍵詞： 華鳈;線粒體DNA;Cytb;D-loop;遺傳多樣性;遺傳分化

中圖分類號： S917.4? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0050-07

華鳈（Sarcocheilichthys sinensis Bleeker），俗稱鳈、石鯽、花石鯽、山鯽魚、山鯉子等，隸屬于鯉科（Cyprindae）、[XCZ5.tif;%118%118]亞科（Gobioninae）、鳈屬（Sarcocheilichthys）[1-2]，廣泛分布于我國平原地區大部分江河、湖泊及其附屬水體中[2]。華鳈不僅可食部分含有率高，肌肉蛋白質含量高，且其風味氨基酸和不飽和脂肪酸含量豐富，必需氨基酸含量均衡，是一種高蛋白、低脂肪、低能量、味道鮮美的優質食用魚類[3]。此外，因其色澤鮮亮、體型小、易飼養等優點，也具有較高的觀賞價值，深受觀賞魚愛好者喜愛[4-5]。

一直以來，華鳈被視為野雜魚類，并未引起重視，然而隨著大型經濟魚類資源的日漸匱乏，包括華鳈在內的小型魚類已成為人們的主要捕撈對象[6]。近年來，由于捕撈強度增加，水體污染，以及人類活動造成的棲息地破壞，華鳈野生資源量銳減[7-8]。目前，人們逐漸認識到了這種小型魚類的經濟價值，并開展了一系列關于其人工馴化[8]、繁殖生物學[9]、人工繁殖[4，10]、生長[5]及胚胎發育[10]等研究工作。然而，關于華鳈遺傳學及基因組學的研究非常有限[11-13]，而針對其群體遺傳結構分析的研究尚未見報道。因此，本研究擬利用Cytb和D-loop 2個線粒體DNA標記對我國東部地區3個華鳈野生群體的遺傳結構進行分析，以了解該地區華鳈自然資源遺傳多樣性現狀，并為今后華鳈種質資源保護及優良苗種人工繁育提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及DNA抽提

課題組于2015年4月至2017年8月在洪澤湖（江蘇省淮安市淮陰區韓橋鄉）、千島湖（浙江省杭州市淳安縣富溪鄉）和西湖（浙江省杭州市西湖北里湖）3個采樣點各采集華鳈樣本15尾。剪取每尾個體的尾鰭組織后浸泡于無水乙醇中，并于4 ℃冰箱中保存備用。采用傳統的苯酚-氯仿法對各樣本基因組DNA進行抽提，DNA質量采用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計進行檢測。

1.2 線粒體DNA片段擴增與測序

本研究選取了線粒體細胞色素b基因（Cytb）和控制區（D-loop）的部分片段作為遺傳標記進行分析。2片段的擴增引物均參考已發表的鯉科魚類通用引物，其中Cytb引物序列為F：5′-[JP9]GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′，R：5′-[JP9]CCTCAGAAGGATATTTGTCCTC-3′[14];D-loop引物序列為F：5′-[JP9]CATCTTAGCATCTTCAGTG-3′，R：5′-[JP9]TCACCCCTGGCTCCCAAAGC-3′[15]。

PCR擴增體系總體積為50 μL，其中包含10×reaction buffer 5 μL，Taq DNA聚合酶4 U（大連寶生物），dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL，上下游引物混合液（2.5 μmol/L）1.6 μL，DNA模板80～200 ng，滅菌超純水36.5 μL。PCR反應在BioRad公司的T-100型PCR儀中進行，PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，運行37個循環;72 ℃終延伸20 min。PCR產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，利用回收試劑盒Gel Extraction Kit（北京康為世紀）對目的片段進行回收和純化，純化后的產物送往武漢艾康健生物科技有限公司，利用ABI3730測序平臺進行測序。

1.3 數據分析

測序所得序列利用Finch TV 1.5軟件進行查看及人工矯正，之后將序列保存為fasta格式，并利用Clustal X 1.83軟件[16]進行比對分析。比對分析完成后將比對結果中5′端和3′端參差不齊的序列刪除，使各序列具有相同的長度。后利用DnaSP 4.50.3軟件[17]分析Cytb和D-loop序列中的多態性核苷酸位點、平均核苷酸差異數（K）、核苷酸多態性參數（π）、單倍型個數、單倍型多態性（Hd）及平均基因流（Nm），此外，利用軟件中的Tajimas D和Fus Fs檢測法進行中性檢測。

在Mega 4.0軟件[18]中，利用Kimura 2-parameter遺傳距離構建單倍型間的Neighbor-Joining （N-J）進化樹，bootstrap值設置為1 000，并利用江西鳈（Sarcocheilichthys kiangsiensis）中相應同源序列作為外類群，GenBank號分別為AY952984.1（Cytb）和KY779851.1（D-loop）。為分析群體間的遺傳差異和遺傳距離，利用Arlequin 3.11軟件[19]進行分子變異分析（AMOVA）和固定系數（Fst）計算。此外，利用IBDWS 3.23軟件（http：//ibdws.sdsu.edu）中的Mantel檢測法對各群體遺傳距離和地理距離間的關聯性進行分析，參數設置均取默認值。

3 討論

3.1 華鳈Cytb和D-loop堿基組成與變異程度

在魚類群體遺傳研究中，線粒體DNA因具有分子量小、進化速度快、母系遺傳和復制相對獨立等優點[20]，在多種魚類群體遺傳結構和遺傳多樣性分析中得到廣泛應用。在線粒體基因組中，不同區域之間的進化速率存在較大差異，一般編碼蛋白質的基因序列進化較慢，而不編碼蛋白的D-loop區域，由于所受選擇壓力較小，一般比其他線粒體基因的進化速率快2.8～5.0倍[21]，是線粒體基因組中進化最快的區域[22]，因此，D-loop包含了更為豐富的遺傳多樣性信息，在水產動物遺傳分析中普遍應用。線粒體DNA上結構和功能解析最為透徹的蛋白質編碼基因中的Cytb基因進化速度適中，在水產動物種群水平差異檢測及種間和種內遺傳分化研究中也被廣泛應用。在水產動物種群遺傳分析研究中，為確保遺傳數據的可靠性，研究人員一般會選擇2個以上的線粒體DNA片段作為遺傳標記，其中利用進化速度快的D-loop序列和進化速度適中的Cytb序列作為標記的研究較多[23-25]。鑒于此，本研究選取D-loop和Cytb序列作為分析華鳈群體遺傳結構的標記，以便更加全面地反映華鳈群體遺傳結構現狀。

在動物線粒體基因組中，A、T、G、C 4種堿基的分布具有明顯的偏倚性，表現為A、T 2種堿基含量明顯高于G、C含量[26]。本研究獲得的Cytb和D-loop序列中，A+T含量均高于G+C含量，這與多種已報道魚類中的比例[21，23-24，27]類似。插入、缺失位點在華鳈Cytb基因序列中未檢測出，而在D-loop序列中共檢測出4個，這也反映出2個序列在進化過程中承受了不同選擇壓力，Cytb基因由于編碼蛋白質，插入、缺失突變極易造成移碼突變而造成蛋白合成障礙，因此，發生這類突變的個體往往被淘汰[26];而D-loop序列由于不編碼蛋白，承受的選擇壓力相對較小，因此，插入、缺失突變在自然選擇過程相對較容易保留下來。正因如此，在已報道魚類中，D-loop序列的多態位點比例一般均比Cytb序列的高[23-24]，然而，本研究卻得到與之相反的結果：D-loop序列的多態位點比例（4.0%）低于Cytb序列中的比例（5.4%），最終導致基于D-loop序列分析所得的單倍型數（7）、單倍型多樣性（0.755±0.036）和核苷酸多樣性（0.006±0.002）均小于基于Cytb序列所得數據（依次為10、0.840±0.033、0.012±0.002）。在另外一種鯉科魚類拉氏[XCZ26.tif;%118%118]（Phoxinus lagowskii）中，也得到了與本研究類似的結果[27]，可見，雖然總體而言線粒體基因組中D-loop序列的變異程度高于蛋白編碼基因序列，但也存在相反情況，而造成這種變化的原因有待進一步研究。

3.2 華鳈遺傳多樣性與群體遺傳分化

遺傳多樣性與生物的生存能力、適應能力和進化潛力密切相關[28]，物種的遺傳多樣性越高，其對環境變化的適應能力越強。而Hd和π是衡量物種或種群線粒體DNA遺傳多樣性程度的2個重要指標，并且有學者以Hd=0.5和π=0.005為界限，將魚類種群分為分為4種類型：低Hd低π型（Hd<0.5，π<0.005）、高Hd低π型（Hd>0.5，π<0.005）、低Hd高π型（Hd<0.5，π>0.005）和高Hd高π型（Hd>0.5，π>0.005）[29]。本研究中，洪澤湖群體基于2個線粒體序列的分析結果均為高Hd高π型;西湖群體基于Cytb時為高Hd高π型，基于D-loop序列時為低Hd低π型;千島湖群體基于Cytb時為高Hd低π型，基于D-loop序列時為低Hd低π型。以上分析結果顯示，洪澤湖群體的遺傳多樣性最豐富，而千島湖群體的遺傳多樣性最低，這從Cytb和D-loop序列在3個群體中的單倍型數目也可反映出（單倍型數目：洪澤湖>西湖>千島湖）。雖然千島湖和西湖華鳈群體的遺傳多樣性較低，但就本研究所取華鳈的總體樣本而言，遺傳多樣性參數仍處于較高水平，這可能是由于不同湖泊的環境因子對華鳈種群的影響與選擇壓力不同所致。千島湖和西湖2個群體基于D-loop序列的核苷酸多樣性指數均處于低水平，說明棲息環境破壞、過度捕撈及人類活動等因素已影響了這2個湖泊華鳈種群規模恢復，急需加強種質資源保護工作。本研究結果與楊培民等在拉氏[XCZ26.tif;%118%118]中所得的研究結果[27]極為類似。

在群體遺傳分化研究中，常用遺傳分化指數Fst來衡量2個群體間的分化程度[30]。在表示群體間的遺傳分化程度時，若Fst介于0～0.05，表示遺傳分化極小;若Fst介于0.05～0.15，表示遺傳分化中等;若Fst介于0.15～0.25，表示遺傳分化較大;若Fst大于0.25，表示遺傳分化極大[31]。本研究中，洪澤湖和千島湖華鳈群體間、千島湖和西湖間均表現為極大的遺傳分化，而洪澤湖與西湖群體間利用Cytb序列的分析結果為中度分化，而基于D-loop序列時則為極大分化。此外，盡管千島湖與西湖均位于浙江省，洪澤湖位于江蘇省，但千島湖與西湖華鳈群體間的遺傳分化程度高于與洪澤湖群體間的分化程度，這可能是由于地形與地勢等環境因素影響了千島湖和西湖華鳈群體間的基因交流，從而表現出的地理距離與遺傳距離間無顯著關聯關系。總體而言，華鳈3個群體間遺傳分化程度較大，群體間基因交流較少，形成了各自的群體特征，其中較多的群體特異性單倍型就是一個直觀的反映。盡管如此，A-MOVA分析結果顯示，華鳈的主要變異來源仍然來自群體內部，這與先前報道的絕大多數魚類的分析結果[23-25]相似。利用Cytb和D-loop序列進行中性檢驗的結果表明，華鳈未發生近期的群體擴張事件，其群體處于較穩定狀態。

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收 稿日期：2019-02-14

基金項目：江蘇省高校自然科學基金面上項目（編號：15KJB240001）;淮陰師范學院博士科研啟動項目（編號：31ZCK00）。

作者簡介：朱傳坤（1984—），男，山東臨沂人，博士，副教授，主要從事魚類基因組學與分子標記輔助育種研究。E-mail：zhuchuankun@hytc.edu.cn。