一株產蛋白酶的中度嗜鹽菌Salinivibrio sp. MK070915的選育及產酶條件優化

耿靜 韓秋霞 高文靜 肖麗嬌

摘要： 以1株篩選自鹽濃度為21%海鹽水的中度嗜鹽菌Salinivibrio sp. MK070915為研究對象，該菌株可產胞外蛋白酶。以Gibbons培養基為基底，采用單因素試驗和最陡爬坡試驗相結合的方法對影響嗜鹽菌產蛋白酶能力的重要培養基成分和工藝條件進行篩選，確定主要影響因子及其取值范圍;并在此基礎上，通過Design-Expert軟件對主要影響因子進行四因素三水平響應面試驗設計，以蛋白酶活性為響應值優化菌株產酶的培養條件，并驗證響應面模型預測值與實測值的一致性。結果表明，最優培養條件如下：以Gibbons培養基為基底，NaCl濃度為5%，pH值為8，培養溫度為20 ℃，碳源為麥芽糖，含量為1.85%，蛋白胨的含量為1.17%，KCl的含量為1.0‰，檸檬酸鈉的含量為5‰，經響應面分析得到的蛋白酶活性為44.09 U，與預期值44.22 U相比，差異為0.299%。結果豐富了嗜鹽蛋白酶的研究和開發依據，為高鹽環境下食品工業催化和農業制劑催化提供了理論基礎。

關鍵詞： 嗜鹽蛋白酶;單因素試驗;響應面法;最陡爬坡試驗;影響因子

中圖分類號： S182? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0287-08

嗜鹽菌通常是指在高鹽環境中可以進行正常生長和生理代謝的微生物[1-2]。在高鹽環境中生長的嗜鹽微生物能夠利用多種營養物質進行代謝活動，并能分泌淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、木聚糖酶和纖維素酶等胞外水解酶，這些酶被稱為嗜鹽水解酶，能夠在高鹽環境下催化完成許多水解反應[1-3]。除此之外，許多嗜鹽水解酶熱穩定性非常好，且能適應廣泛的pH值環境。由于具有這些獨特的性質，嗜鹽水解酶在不利的條件下對生物技術應用具有吸引力[4-7]。

優化發酵培養基和工藝條件是提高蛋白酶產量的重要途徑之一，也是開發低成本發酵工藝的重要步驟之一[8-10]。響應面分析法（RSM）是酶工業生產中培養基優化和工藝優化的有效工具。在優化之前篩選重要參數非常重要，其目的是忽略次要參數，減少試驗次數，以方便試驗的進行，其中單因素試驗和最陡爬坡試驗相結合的方法是最為常用的研究手段[10-13]。本研究以1株篩選自21%海鹽水的可產蛋白酶的中度嗜鹽菌為研究對象，采用單因素試驗和最陡爬坡試驗相結合的方法分析菌株產蛋白酶的主要影響因素，確定各因素最佳濃度，并在此基礎上進行四因素三水平響應面試驗設計，進行驗證試驗，進而得到菌株產蛋白酶的最優培養基成分和工藝條件。

1 材料與方法

1.1 菌株樣品來源

采集山東省昌邑市某鹽場濃度為21%海鹽水水平面下15 cm處的水樣，4 ℃暫存。帶回后稀釋水樣并涂布，分離純化后，得到中度嗜鹽菌MK070915，斜面保藏于冰箱中。

1.2 試劑和培養基

1.2.1 主要試劑

干酪素，購自北京Solatrio有限公司;福林酚試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司;三氯乙酸，購自天津市廣成化學試劑有限公司;碳酸鈉購自天津市巴斯夫化工貿易有限公司;L-酪氨酸，購自天津迪博化工有限公司。

1.2.2 培養基

液體Gibbons培養基（GM）：酪素水解物5 g，酵母浸出物10 g，蛋白胨5 g，檸檬酸鈉 3 g，MgSO4·7H2O 20 g，KCl 2 g，NaCl 100 g，蒸餾水1 000 mL。固體GM：在液體GM的基礎上添加2%的瓊脂。滅菌條件：121 ℃，20 min。

篩選培養基：在固體GM的基礎上添加1%脫脂奶粉。滅菌條件：115 ℃，10 min。

1.3 產蛋白酶菌株的篩選

1.3.1 菌株的初篩

將純化后的菌株點種于篩選培養基上，37 ℃下倒置培養3～5 d，觀察菌落周圍是否出現透明水解圈。

1.3.2 菌株的復篩

1.3.2.1 粗酶液的制備

將純化后的菌株按2%（質量/體積）的比例接種至液體GM中，在 37 ℃、200 r/min 條件下培養72 h后，將菌液在4 ℃、8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液，即粗酶液，備用。

1.3.2.2 菌株的復篩

制作牛奶-鹽-瓊脂固體平板并放置牛津小杯，作標記;以空白GM作對照，未離心的菌液作為試驗組1，粗酶液作為試驗組2，分別加入到牛津小杯中，于37 ℃培養箱中放置 12 h，觀察透明圈生成情況。

牛奶-鹽-瓊脂固體培養基：脫脂牛奶25 g，NaCl 25 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂添加量2%。

1.4 福林酚法測定蛋白酶活性

參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》，采用福林酚法測定蛋白酶活性。

酶活性定義：將在溫度為40 ℃、pH值為7.0的條件下，1 mL粗酶液1 min水解酪素產生1 μg酪氨酸作為1個酶活性單位，用U來表示。

1.5 系統發育分析

委托生工生物工程（上海）股份有限公司對活化后的菌株進行16S rDNA測序，并采用MEGA 7.0軟件中的鄰接法對所測得的序列進行系統發育樹構建[2]。

1.6 菌株生長條件和營養物質利用

1.6.1 菌株生長條件

將液體GM的NaCl濃度分別設置為0、5%、10%、15%、20%、25%，pH值分別設置為5、6、7、8、9、10;將培養溫度分別設置為10、15、20、25、30、35、40 ℃;向液體GM中分別添加金屬離子Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+，使各金屬離子終濃度為5 mmol/L。將活化后的菌株按2%（質量/體積）的比例接種至上述培養基中，于37 ℃、200 r/min 下振蕩培養72 h;每隔4 h取樣1次，制備粗酶液，測定蛋白酶活性。

1.6.2 營養物質的利用

以酵母浸出物（對照）葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、麥芽糖和甘露醇為唯一碳源添加到液體GM中;以蛋白胨（對照）、脫脂牛奶、明膠、牛肉浸粉、胰蛋白胨、酪蛋白、酵母浸粉、酪素水解物、氯化銨、亞硝酸鈉和硝酸銨為唯一氮源添加到液體GM中，將活化后的菌株按2%（質量/體積）的比例分別接種至上述培養基中，于 37 ℃、200 r/min下振蕩培養72 h，制備粗酶液，測定蛋白酶活性。

1.7 單因素試驗和最陡爬坡試驗

對培養基的各組成部分進行產酶單因素試驗，根據單因素試驗結果，分別設置4個因素的最陡爬坡試驗，按照不同因素、不同水平配制培養基，將活化后的菌株按2%（質量/體積）的比例接種于上述培養基中，于37 ℃、200 r/min下振蕩培養72 h，制備粗酶液，測定蛋白酶活性。單因素試驗設置如下：碳源濃度梯度為0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%;氮源濃度梯度為0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%;KCl添加終濃度分別為0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰、3.0‰;檸檬酸鈉添加終濃度分別為1‰、2‰、3‰、4‰、5‰、6‰。

1.8 響應面法優化菌株產酶條件

根據單因素試驗結果以及Box-Behnken設計原則，4個因素分別以A（麥芽糖）、B（蛋白胨）、C（KCl）和D（檸檬酸鈉）表示，以單因素試驗結果的最佳條件作為中水平，即0水平，響應面試驗設計的因素和水平見表1。

1.9 數據處理

生長特性和產酶特性試驗分別設置3組平行樣品，按照時間間隔分別取樣測定蛋白酶活性，取平均值，并繪制生長特性和產酶特性曲線。營養物質利用試驗、單因素試驗以及最陡爬坡試驗均測定3次，用SPSS 18.0軟件為測得的數據進行顯著性分析，并根據響應面結果對優化數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離篩選

如圖1所示，菌株MK070915在初篩平板上產生透明水解圈，說明其具有產蛋白酶的能力。

2.2 系統發育分析

將通過生工生物工程（上海）股份有限公司測序得到的16S rDNA序列提交到GenBank中進行同源性比較，并利用MEGA 7.0軟件中的鄰接法進行系統發育樹的構建，結果如圖2所示。MK070915菌株與Salinivibrio屬內Salinivibrio costicola 18 AG的同源性為91%，說明它們為同種微生物，結合形態學和生理生化特征，確定該菌株為Salinivibrio屬成員，因此將其命名為Salinivibrio sp. MK070915。

2.3 福林酚法測定蛋白酶活性標準曲線

采用福林酚法測定蛋白酶活性，以標準品 L-酪氨酸濃度（x）為橫坐標、對應濃度的吸光度（y）為縱坐標繪制蛋白酶活性標準曲線（圖3）。曲線方程為y=0.011 0x+0.033 3，r2=0.999 5，可信度較高，可用。而蛋白酶活性的計算公式為

x=D×K×n×4/10。

式中：x為樣品的蛋白酶活性，U/g或U/mL;D為平行試驗中樣品的平均吸光度;K為吸光常數;n為稀釋倍數。帶入方程可得，K=84.374。

2.4 菌株生長條件和營養物質利用

經3次試驗發現，MK070915菌株均不能生長于NaCl濃度為0%、20%、25%以及pH值為5和10的條件下，因此本研究不再對這些處理進行分析。如圖4-A所示，菌株可以在NaCl濃度為5%～15%的培養基中生長并產生蛋白酶，當NaCl濃度為5%時，該菌株的生長和產酶能力最大，因此，判斷該菌株為中度嗜鹽菌，并選擇5%的NaCl濃度進行下一步生長條件探索。如圖4-B所示，培養基pH值在6～9之間時，菌株均可以生長并產生蛋白酶;當pH值為5和10時，菌株無法生長;當pH值為8時，菌株產酶能力高于其他pH值條件，因此選擇8為該菌株產酶的最適pH值。如圖4-C所示，菌株在10～40 ℃條件下可以進行生長和產生蛋白酶，溫度適應范圍較廣;當培養溫度為20 ℃時，該菌株的產酶能力最強;當培養溫度在15～25 ℃之間時，溫度對該菌株產酶能力的促進作用比較明顯。如圖4-D所示，Fe3+、Ni2+、Cu2+、Mn2+的添加對菌株后期的產酶能力具有促進作用，但是對應培養條件下的菌株產酶開始的時間為36 h左右，說明上述金屬離子的存在對于菌株前期的產酶活性具有一定的抑制作用，Zn2+的存在使得菌株無法正常生長，其他金屬離子的存在不影響菌株生長和產酶，但是對應培養條件下的菌株產酶能力相較于未添加金屬離子的原液差。

菌株Salinivibrio sp. MK070915可以利用多種營養物質作為碳源和氮源，這與已報道的嗜鹽菌產蛋白酶的特點[15]相吻合。如圖5-A所示，碳源為麥芽糖時，菌株的產酶活性比原培養基中以酵母浸出物為碳源時增加了1.74倍;如圖5-B所示，氮源為蛋白胨時，菌株所產蛋白酶表現出來的活性最高，而其他氮源的添加并沒有明顯地提高菌株產蛋白酶的能力，當將酪素水解物和亞硝酸鈉作為唯一氮源添加到培養基中時，甚至抑制了菌株產蛋白酶的能力。因此選用麥芽糖作為碳源替代GM中的酵母浸出物，氮源物質仍為原培養基中的蛋白胨。

2.5 單因素試驗和最陡爬坡試驗

針對單因素試驗設計中對菌株產蛋白酶影響最大的4個因素進行最陡爬坡試驗，分別于各個因素各水平條件下接種活化后的菌株，在37 ℃、200 r/min 條件下振蕩培養72 h后測定粗酶液蛋白酶活性。如圖6所示，麥芽糖添加量為 1.5% 時，蛋白酶活性達到最大值，添加量超過2.5%時，蛋白酶活性急劇下降;蛋白胨作為最優氮源，最佳添加量為1.0%;KCl的最佳添加量為2.0‰，而檸檬酸鈉的最佳添加量為4‰。然而最優發酵條件并不一定是各個單因素所得最佳條件的簡單組合，需要在單因素基礎上進行響應面試驗來確定最優的發酵培養條件。響應面試驗各因素水平的選擇如下：麥芽糖添加量為1.25%～1.75%，蛋白胨添加量為 0.75%～1.25%，KCl添加量為1.0‰～3.0‰，檸檬酸鈉添加量為3‰～5‰;將蛋白酶活性作為響應值。

2.6 響應面優化產酶條件

以麥芽糖（A）、蛋白胨（B）、KCl（C）和檸檬酸鈉（D）為試驗因素，蛋白酶活性為評價指標，按照二次項回歸方程進行試驗。試驗設計及結果見表2。

根據表2的試驗結果，通過響應面軟件處理后確定回歸方程為蛋白酶活性=37.22-2.91A+2.52B-3.93C+0.40D+2.72AB-5.97AC-2.27AD+2.24BC+0.75BD-3.44CD-1.86A2-2.20B2-2.08C2+0.70D2。

根據響應面試驗結果，構建的回歸模型的方差分析結果見表3。

由表3可知，本試驗所得模型P值為0.000 4，說明模型極顯著（P<0.01）;模型失擬項的P值為0.382 7，說明模型失擬項不顯著。一次項A、B、C對菌株產蛋白酶能力的影響極顯著（P<0.01）;二次項B2、C2對菌株產蛋白酶能力的影響顯著（P<0.05）。兩因子試驗，麥芽糖和KCl、KCl與檸檬酸鈉之間交互作用對菌株產蛋白酶能力的影響極顯著（P<0.01）;麥芽糖與蛋白胨之間的交互作用對菌株產蛋白酶能力的影響顯著（P<0.05）。

以蛋白酶的活性為響應值，采用軟件作響應曲面圖。如圖7-A所示，曲面圖形的頂點落在中心位置左右，區域俯視圖趨近于橢圓形，說明麥芽糖和蛋白胨的交互作用對菌株產蛋白酶能力的影響顯著;麥芽糖和KCl交互作用的響應曲面如圖7-B所示，檸檬酸鈉和KCl交互作用的相應曲面如 圖7-F所示，2個曲面圖形的頂點落在中心位置，說明它們之間的交互作用對菌株產蛋白酶能力的影響較為顯著;麥芽糖和檸檬酸鈉交互作用的響應曲面如圖7-C所示，蛋白胨和檸檬酸鈉交互作用的響應曲面如圖7-E所示，2個曲面圖形的曲線比較平穩，區域俯視圖趨近于橢圓形，說明它們之間的交互作用對菌株產蛋白酶能力的影響不顯著;蛋白胨和KCl交互作用的響應曲面如圖7-D所示，曲面圖形的曲線較陡，區域俯視圖形也趨近于橢圓形，然而，橢圓形區域并無實線，說明它們之間的交互作用并沒有體現在此模型中。

通過Design-Expert 8.0.5b軟件進行培養條件的優化，最優培養條件如下：以Gibbons培養基為基底，添加5% NaCl，調整pH值為8，設置培養溫度為20 ℃，碳源為麥芽糖，含量為1.85%，氮源為蛋白胨，含量為1.17%，添加1.0‰ KCl、5‰檸檬酸鈉。根據響應面試驗結果得出的最優方案對培養基進行改進，以此檢驗響應面法所得結果的可行性，經過3次重復性試驗，最終得到的蛋白酶活性可達 44.09 U，與預期值44.22 U相比，差異為0.294%，表明該模型合理可靠， 所優化的最佳培養條件能夠被用于蛋白酶的高效產酶培養。

3 討論與結論

從鹽濃度為21%的曬鹽場海鹽水中分離得到1株Salinivibrio屬的中度嗜鹽菌MK070915，該菌株在適宜培養條件下可產胞外蛋白酶。

采用固體Gibbons培養基，對該菌株進行分離純化，并進行菌株產蛋白酶的篩選，結果發現，該菌株在篩選培養基上產生較大的透明水解圈，說明它具有較強的產蛋白酶能力;通過進一步對菌株的生長特性和營養物質利用進行探究發現，該菌株可以在NaCl濃度為5%～10%、pH值為6～9、溫度為 10～40 ℃的條件下生長并產蛋白酶，且可以利用葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、麥芽糖和甘露醇為碳源，利用蛋白胨、脫脂牛奶、明膠、牛肉浸粉、胰蛋白胨、酵母浸粉、酪蛋白、氯化銨和硝酸銨為氮源。利用單因素試驗、最陡爬坡試驗結合響應面法優化了該菌株產胞外蛋白酶的最適培養條件：以Gibbons培養基為基底，添加5% NaCl，調整pH值為8，設置培養溫度為20 ℃，碳源為麥芽糖，含量為1.85%;氮源為蛋白胨，含量為 1.17%，KCl含量為1.0‰，檸檬酸鈉含量為5‰。經響應面分析得到的蛋白酶活性為44.09 U，而預期值為44.22 U，二者之間的差異為0.294%。

本研究中的可產蛋白酶的中度嗜鹽菌菌株Salinivibrio sp. MK070915經過優化之后，其蛋白酶活性明顯提高，與2007年報道的菌株Salinivibrio sp. AF-2004所產蛋白酶[15]相比，酶活性提高尤為明顯;其中溫度對蛋白酶活性的影響較大，20 ℃作為發酵溫度，可以有效的節能減排。

參考文獻：

[1]侯 靖，徐佳琪，崔恒林. 嗜鹽古菌Halorussu sp.XZYJ18產胞外蛋白酶特點及其酶學性質[J]. 中國調味品，2018，43（9）：11-16.

[2]董 偉，郭立忠，李翠翠，等. 一株高產酯酶中度嗜鹽菌的分離、鑒定及酯酶部分酶學性質的研究[J]. 微生物學通報，2009，36（4）：479-483.

[3]倪志華，張玉明，周艷芬. 一株中性嗜鹽菌Halobacillus dabanensis N522的分離鑒定及其抗菌活性研究[J]. 生物技術通報，2016，32（5）：158-164.

[4]Siti S D，Ihsanawati，Hertadi R. Isolationg and characterization of organic-solvent stable protease isolated by Pseudomonas stutzeri BK AB-12[J]. Procedia Chemistry，2015，16：341-348.

[5]Chuprom J，Bovonreungroj P，Ahmad M，et al. Approach toward enhancement of halophilic protease production by Halobacrerium sp. strain LBU50301 using statistical design response surface methodology[J]. Biotechnology Reports，2016，10：17-28.

[6]DasSarma S，DasSarma P. Halophilies and their enzymes：negativity put to good use[J]. Current Opinion in Microbiology，2015，25：120-126.

[7]夏 珺. 山東省三處鹽場環境中嗜鹽菌多樣性調查及六株嗜鹽新菌的分類學研究[D]. 濟南：山東大學，2016.

[8]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.蛋白酶活力測定法：SB/T 10317—1999[S]. 北京：國家標準出版社，1999.

[9]侯 靖，徐佳琪，李 楊，等. 一平浪鹽礦產蛋白酶嗜鹽古菌的鑒定及其酶學性質[J]. 食品工業科技，2017，38（23）：124-128.

[10]蘇同偉，包 斌，嚴 婷，等. 響應面法優化海洋微生物發酵產生纖溶化合物的培養條件[J]. 生物工程學報，2013，29（6）：857-861.

[11]陳蔚青，李一飛，申屠超. 響應面法優化一株中度嗜鹽菌的培養條件[J]. 食品工業科技，2013，34（1）：140-144.

[12]趙夢琴. 一株嗜鹽古生菌胞外蛋白酶的酶學特性的研究及產酶條件的優化[D]. 鎮江：江蘇大學，2017.

[13]曹 禮，張學虹，趙惠蓉，等. 響應面法優化鹽堿土中所得一株細菌的培養條件[J]. 中國釀造，2018，37（2）：91-94.

[14]龐豐平，霍乃蕊. 響應面法優化瑞士乳桿菌產蛋白酶培養條件[J]. 中國調味品，2017，42（4）：4-8.

[15]Ali Amoozegar M，Zahra Fatemi A，Reza Karbalaei-Heidari H，et al. Production of an extracellular alkaline metalloprotease from a newly isolated，moderately halophile，Salinivibrio sp. strain AF-2004[J]. Microbiological Research，2007，162（4）：369-377.

收 稿日期：2018-12-24

基金項目：山東省自然科學基金（編號：ZR2014EMM005）。

作者簡介：耿 靜（1993—），女，山東淄博人，碩士研究生，研究方向為嗜鹽微生物產酶。E-mail：15764230941@163.com。