基于適配體的生物膜干涉檢測重組人促紅細胞生成素α新方法

賀小琴 羅黎 郭磊 謝劍煒

摘?要?采用生物膜干涉（BLI）表面敏感光譜技術，建立了一種基于鏈DNA適配體39 nt的傳感分析方法，實現了重組人促紅細胞生成素α（EPO-α）的靈敏檢測。將生物素化的39 nt固定于鏈霉親和素傳感芯片上，經2200 r/min高速振蕩實現微升體積分析物的快速擴散。對適配體39 nt的取向、在BLI傳感芯片上的固定濃度和非特異性吸附等影響因素進行了考察，發現50 nmol/L 3末端生物素化39 nt具有最佳響應信號;加入Tween 20和牛血清白蛋白（BSA）可有效克服非特異吸附。基于麥胚凝集素構建了夾心法信號放大體系，在Tris-TB生理緩沖溶液中，檢測EPO-α的線性范圍為10～200 nmol/L，檢出限為5 nmol/L。應用于人血漿等復雜基質中的EPO-α檢測，回收率為86.7%～104.2%，RSD<11%，結果令人滿意。此BLI傳感體系為免標記蛋白相互作用和復雜生物樣品檢測等實際應用提供了有益參考。

關鍵詞?適配體;重組人促紅細胞生成素;生物膜干涉;麥胚凝集素;信號放大

1?引 言

核酸適配體能夠形成特定的空間結構，與靶分子通過空間互補發生特異性結合。其結合特性與抗體性質類似，因此，適配體又被稱為“化學抗體”。適配體也是一類優良的分析傳感元件，除直接利用其與靶蛋白間的高親和力、高特異性結合特性外，還可利用適配體的修飾、標記、與互補序列形成競爭、與納米器件的良好相容性等性能，發展各種分析檢測和傳感方法[1]。

生物膜干涉技術（Biolayer interferometry，BLI）是新興的生物傳感手段之一[2]，其檢測原理是光通過傳感芯片的生物膜層后發生透射與反射，反射光的頻率與生物膜層厚度有關。一些頻率的反射光與入射光發生相長干涉，而另一些發生相消干涉，從而形成干涉光譜。BLI技術通過檢測干涉光譜的相對位移變化，反映傳感芯片表面生物膜的厚度。當固定于生物膜表面上的配體與溶液中的分析物結合后，生物膜層厚度增加，產生相對位移，隨著分析物結合量的增加而增大，最后可達到平衡，據此進行定量分析。因此，BLI是一種表面敏感的光譜技術，具有免標記、實時、可提供分子相互作用特征信息以及簡單易用等優點。目前，已有使用BLI技術的基于適配體的傳感方法的報道，包括適配體結合/競爭法檢測生物毒素：膝溝藻毒素[3]、石芳蛤毒素[4]、海葵毒素[5]，DNA四面體結合適配體檢測三磷酸腺苷[6]，適配體-抗體夾心檢測癌胚抗原125[7]，以及酶聯適配體吸附分析血小板衍生生長因子-BB[8]等。檢測靈敏度多處于nmol/L或亞nmol/L水平，但多數尚未應用于實際樣品測定中。BLI是通過干涉光譜的位移變化，反映傳感膜表面的厚度及密度變化，通常響應信號較低，常需進行信號放大。

2019年度的諾貝爾生理學或醫學獎授予了在細胞低氧感知與適應機制方面做出突出貢獻的科學家，促紅細胞生成素（EPO）即是該機制中的關鍵分子之一，作為重要的造血因子，其主要生理功能是促進紅細胞增殖和分化，改善機體的攜氧能力和增強耐力。在本研究組的前期工作中，針對重組人促紅細胞生成素（EPO-α），發展了凝集素導向的親和層析SELEX技術，成功篩選到了新型單鏈DNA（ssDNA）適配體序列807-39 nt（以下簡稱39 nt）[9]，并結合適配體后篩選技術[10]，明確了39 nt及其最短親和性序列的高級結構特征[11]，為分析、傳感、診斷等應用領域提供了一類作用特點清晰的適配體元件。本研究建立了以適配體39 nt為分析傳感元件的BLI新方法，將生物素化的適配體固定于鏈霉親和素（SA）傳感芯片上，考察了適配體的親和性發揮，特別是研究了適配體元件的取向、固定濃度等關鍵因素的影響，成功構建了基于麥胚凝集素（WGA）夾心法的信號放大策略，實現了復雜基質人血漿的中EPO-α的靈敏、準確檢測。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

BLITZ單樣本分子相互作用分析儀（美國ForteBio公司），SA傳感芯片（ForteBio公司）。SA傳感芯片為即插即用式，裝載固定于分析儀機身上方正中;分析儀機身下部是不同尺寸的樣品池，使用時按需手動平移對準至芯片正下方。所有核酸適配體序列的變性、復性步驟于PCR儀（德國Eppendorf公司）上完成，均為95℃變性5 min，然后以1℃/min緩慢降至室溫。

所有寡核苷酸序列均為上海生工生物技術公司合成，39 nt的序列為GATTGAAAGGTCTGTTTTTGGGGTTGGTTTGGGTCAATA;EPO-α（3.25 mg/mL，純度>98.5%，深圳賽保爾生物藥業有限公司）;WGA、吐溫20（Tween 20）、人IgG、刀豆凝集素（美國Sigma-Aldrich公司）。三羥甲基氨基甲烷（Tris）、HCl、NaCl、KCl、MgCl2、牛血清白蛋白（BSA）、鐵蛋白（國藥集團北京化學試劑公司）。人空白血漿由解放軍第五醫學中心提供。所用試劑至少為分析純。實驗前，所有的緩沖液經0.22 μm微孔水相濾膜（天津津騰公司）過濾并超聲脫氣。實驗用水為Milli-Q A10超純水儀（美國Millipore公司）制備的超純水（18.2 MΩ·cm）。所有溶液使用之前，均經高壓蒸汽滅菌處理。

2.2?實驗方法

SA傳感芯片在Tris-TB緩沖液（即20 mmol/L Tris、140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、5 mmol/L MgCl2、0.05%（V/V）Tween-20、 5 μmol/L BSA，以HCl調節至pH 7.4～7.6）中浸泡10 min后（“水化”），依次裝入到不同尺寸的樣品池中（200 μL黑色離心管用于采集基線或樣品的解離曲線、4 μL石英樣品池用于采集樣品的結合曲線），以實現上樣、結合、解離和再生，溫度25℃，振蕩速率2200 r/min。SA芯片每日使用后吹干保存，次日經過水化處理后，即可繼續使用。

檢測EPO-α蛋白時，在固定了3-Bio-39 nt的SA傳感芯片上，分別以含0、1、2、5、10、20、50、100、200、500和1000 nmol/L EPO-α的Tris-TB溶液作為分析物，結合時間均為300 s，解離300 s。或上述分析物的結合時間均為300 s，解離30 s，之后分別進樣1 μmol/L WGA（溶于Tris-TB緩沖液），結合時間為180 s，解離240 s。50%人血漿樣品由EPO-α的Tris-TB溶液與人血漿以1∶1（V/V）混合配制得到。響應曲線通過單個傳感芯片自身扣減溶液空白得到，以去除或降低非特異性結合以及緩沖液自身產生的干涉光譜偏移。數據采集及擬合使用BLItz Pro1.2軟件（美國ForteBio公司），擬合采用線性（定量曲線）或非線性擬合模型（1∶1結合，濃度滴定曲線）。

3?結果與討論

3.1?BLI工作體系的構建

BLI技術是一種新型的即插即讀式傳感技術，可以實現單通道或多通道的同時分析。本研究采用了小型、單通道的BLITZ，其核心部件是振蕩式平板（振蕩頻率通常在1000～2200 r/min之間）及光纖式傳感芯片，樣品處于敞開式樣品池中，最低樣品體積僅需要4 μL。與表面等離子體共振（SPR）技術相比，BLI無需與微流控系統相連，不受分子的物質遷移效應等影響，而是通過高速振蕩微小體積樣品，達到分析物在傳感膜表面快速擴散的目的。因此，對于樣品前處理要求較低，可直接針對細胞粗提液和血漿等進行分析。其不足之處在于相互作用分子固定在芯片上時，其結合性易受標記及固定策略的影響。

本研究中，適配體39 nt經單分子生物素化修飾[10]后，固定于SA傳感芯片表面，引入WGA信號放大策略，構建了一種穩定、簡便、靈敏的BLI分子互作體系，實現了EPO-α蛋白的靈敏檢測，并用于人血漿實際樣品的檢測（圖1）。

3.2?生物素化適配體的固定

3.2.1?生物素化適配體的空間取向?適配體分子的親和性與其堿基排布和形成的空間結構直接相關。前期工作表明，基于ssDNA適配體 39 nt結構所發展的向左縮進（即去除3-末端堿基）分子群和向右縮進（即去除5-末端堿基）分子群，對EPO-α表現出不同的親和特性。多種分析方法的結果表明，39 nt與EPO-α結合時，其解離常數（KD）在30～90 nmol/L范圍（凝膠遷移率變動分析，KD=（39±27） nmol/L[9];親和毛細管電泳-激光誘導熒光法，KD=（86±13） nmol/L[12];SPR，KD=（54±2） nmol/L[10]）。

但是，序列39 nt向左縮進，去除3-末端2、4、6個堿基時，對親和力影響不明顯（KD值上升至320～390 nmol/L），說明此段堿基主要起支撐作用;而向右縮進，去除5-末端2、4個堿基后，對親和力影響顯著（KD值上升至560～1300 nmol/L）;但去除5-末端6、8個堿基后，親和力又隨之基本恢復（KD值下降至130～140 nmol/L）[10]，說明此段堿基除具有支撐作用外，還具有掩蔽鄰近關鍵堿基的作用。因此，首先考察了39 nt的5-末端或3-末端偶聯上生物素后，對EPO-α蛋白檢測的影響。

實驗結果表明，50 nmol/L 3-末端生物素化39 nt（3-Bio-39 nt）和5-末端生物素化39 nt（5-Bio-39 nt）在SA芯片上固定300 s后，生物膜上結合響應值分別增加了1.30和1.50 nm，說明兩種生物素化的適配體在SA上固定的數量較為接近。但是，當以500 nmol/L EPO-α蛋白為分析物，3-Bio-39 nt為固定分子時，EPO-α的結合使結合響應值繼續升高0.33 nm，顯著高于5-Bio-39 nt為固定分子的0.14 nm（圖2）。說明39 nt的3-末端生物素化時，很好地利用到了該末端堿基僅起支撐作用的特點，將參與識別的關鍵堿基位點等盡量暴露于EPO-α蛋白，從而獲得較高靈敏度。

3.2.2?用于固定的適配體濃度?在表面傳感技術中，傳感芯片表面配體分子的密度非常重要。固定配體密度過低，配體不能完全發揮親和性;密度過高，則可能導致舞蹈效應（同一分析物連續作用于不同配體分子）、空間位阻效應，反而使配體-分析物間的結合降低[13]。因此，用于固定的適配體39 nt的濃度是關鍵實驗參數之一。

如圖3A所示，隨著適配體濃度（25～500 nmol/L）增加，SA芯片上固定的3-Bio-39 nt數量增加，密度增大，響應信號逐漸增加。但是，對于分析物EPO-α蛋白（500 nmol/L），較低濃度適配體（50 和25 nmol/L）反而有高的結合響應值（圖3B）。說明此時適配體之間存在合適的固定間距，有利于其對靶分子親和識別。因此，選用具有最高結合響應值的50 nmol/L 3-Bio-39 nt，用于SA芯片固定。

3.3?EPO-α檢測條件的優化

在緩沖溶液中加入了非離子型表面活性劑Tween 20，較好地減弱了分析物EPO-α蛋白和SA蛋白間的非特異吸附作用。實驗結果表明，加入0.01%～0.05%（V/V）Tween 20后，響應信號增加了15%;再加入常用封閉劑BSA（0.1～50 μmol/L），特別是BSA濃度大于5 μmol/L時，響應信號可提升50%。

傳感芯片的再生性能對于單通道多次連續測定非常重要。NaOH溶液是針對適配體-靶蛋白相互作用進行再生時的較優選擇。

考察了不同濃度NaOH的再生效果（圖4）。由進樣前后基線響應變化可知，當NaOH濃度分別為0.1、0.05和0.02 mmol/L時，每次再生后，基線稍下降約0.02 nm。但在有限再生次數（≤10次）時，500 nmol/L EPO-α的結合響應值仍基本一致。因此，在體系再生時，根據所結合的分析物在洗脫后是否回歸基線的原則選擇再生次數。對于濃度小于200 nmol/L的低濃度分析物，再生條件選用0.02 mmol/L NaOH處理2～3次，每次5 s;對于濃度大于200 nmol/L的較高濃度分析物，再生條件選用 0.1 mmol/L NaOH處理2～3次，每次5 s。這也體現了單通道BLI技術工作環境敞開、方便、易控的優點。

3.4?基于適配體39 nt的信號放大型檢測EPO-α

基于上述的優化條件，僅以固定的3-Bio-39 nt為親和分子時，最低可檢測到12.5 nmol/L EPO-α，但在12.5～50.0 nmol/L范圍時并不呈線性響應，原因可能在于EPO-α蛋白屬于較低分子量的蛋白（分子量34 kDa），其結合導致的生物膜厚度增加并不明顯[2，14]。考慮到BLI檢測信號與生物膜表面結合的分子數量和質量直接相關，本研究引入WGA為信號放大分子，以進一步提高EPO-α蛋白的響應。

WGA為同型二聚體糖蛋白，分子量36 kDa，每個亞單位存在兩個N-乙酰氨基葡萄糖（GlaNAc）結合位點[15]。本研究組前期的工作[10]表明，WGA與適配體在EPO-α上具有不同的結合位點，WGA與適配體可與酸性糖蛋白EPO-α形成“三明治”夾心結構。由圖5可見，隨著WGA濃度增加，對于相同濃度的EPO-α（500 nmol/L），第二級響應信號的放大作用較為明顯;WGA的濃度高于200 nmol/L時，EPO-α 檢測信號顯著增強。選用1 μmol/L WGA進行信號放大，實現了EPO-α的靈敏檢測，線性方程為y=0.002x-0.025（R2=0.980），線性范圍為10～200 nmol/L，檢出限（S/N=3）為5 nmol/L。

本方法中，低（20 nmol/L）、中（100 nmol/L）、高（200 nmol/L）濃度的EPO-α的日間精密度（n=5）分別為8.2%、12.7%和9.4%。100 nmol/L EPO-α和10倍濃度的常見蛋白（如人IgG、刀豆凝集素、鐵蛋白）共存時，回收率分別為86.5%±8.5%、96.1%±3.5%和95.7%±1.3%，說明常見蛋白對本方法沒有明顯干擾。針對50%人血漿實際樣品，用本方法進行了測定，加標回收率均在86.7%～104.2%之間（表1），RSD<11%，說明本方法可用于血漿等復雜基質中EPO-α的準確測定。血漿稀釋1倍后即可直接檢測，方法簡便，抗干擾能力強。

4?結 論

建立了基于適配體的BLI方法，實現了EPO-α的靈敏檢測。優化了SA傳感芯片表面固定的生物素化適配體元件的取向和濃度，利用WGA和適配體39 nt作用于EPO-α的不同位點的特性，成功構建了BLI信號放大傳感體系，用于EPO-α的檢測，檢出限為5 nmol/L。此BLI傳感體系的開發，為適配體與靶分子間相互作用研究提供了參考。借助于其它更高質量的信號放大分子（如EPO抗體）、納米器件（如WGA或EPO抗體標記的金納米粒子等）或酶催化方法體系，可望實現更為靈敏的檢測，拓展本體系的實用價值。

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