廣東甘薯瘡痂病病原菌鑒定

于琳 佘小漫 藍國兵 湯亞飛 李正剛 鄧銘光 何自福

摘要：【目的】明確廣東甘薯瘡痂病的病原菌種類及生物學和系統發育學特征，為甘薯瘡痂病防治及抗病育種提供參考。【方法】從廣東省茂名和湛江等甘薯產區采集甘薯瘡痂病植株，采用分生孢子懸液梯度稀釋分離法分離病原菌，通過病原菌的形態特征觀察、致病力測定，結合核糖體內轉錄間隔區（ITS）、28S核糖體RNA（LSU）、RNA聚合酶II第二大亞基（rpb2）和翻譯延伸因子1-α（TEF1）部分序列的多核苷酸序列系統學分析等方法對病原菌進行鑒定。【結果】共分離獲得26株單分生孢子分離物，隨機選取3株代表性菌株SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3進行觀察和測定。光學顯微鏡下觀察發現，3株代表性菌株的產孢細胞透明，內生芽殖;分生孢子單細胞，透明，短棒形，兩側頂端鈍圓，大小為6.1～9.0 ?m×2.2～3.0 ?m;分生孢子梗短棒狀;致病性人工接種表明，3株代表性菌株均可侵染甘薯引起典型的瘡痂病癥狀。3株代表菌株的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列與痂囊腔菌屬（Elsino?）的E. ampelina、E. bidentis、E. arachidis、E. mimosae、E. ricini和E. sesseae等多個種的對應序列一致性為95%～99%。系統發育進化樹分析結果顯示，3株代表性菌株與蓖麻痂囊腔菌（E. ricini）單獨聚成一支。【結論】廣東甘薯瘡痂病的病原菌為甘薯痂囊腔菌（E. batatas）。

關鍵詞： 甘薯;瘡痂病;鑒定;Elsino? batatas;系統發育分析;廣東省

0 引言

【研究意義】甘薯是我國重要的糧食作物之一，甘薯瘡痂病（Sweet potato scab）是甘薯生產上的一種毀滅性病害，是我國南方甘薯產區三大病害之一（黃實輝等，2011）。廣東甘薯種植歷史悠久，近年來種植面積達40萬ha（劉翀等，2016），是我國南方最大的甘薯產區。廣東濕潤多雨的氣候環境極易導致甘薯瘡痂病的發生與流行，病害若在甘薯植株生長前期發生，產量損失可達30%～70%，造成嚴重的經濟損失（黃實輝等，2011）。鑒于甘薯瘡痂病對廣東甘薯產業的嚴重危害，非常有必要對其病原菌進行鑒定，為生產上防治該病害提供科學依據。【前人研究進展】甘薯瘡痂病具有悠久的流行歷史，該病害呈世界性分布，在中國、美國、巴西、日本、馬來西亞和斐濟等國均有發生（Ames and OSullivan，2014）。Sawada（1931）首次報道1910—1928年我國臺灣甘薯瘡痂病的發生情況，鑒定病原菌的無性階段形態特征，將病原菌的無性型命名為Sphaceloma batatas Sawada;隨后Goto（1937）在日本發現甘薯發生瘡痂病;Jenkins和Viégas（1943）鑒定了該病原菌的有性型，重命名為Elsino? batatas Viégas & Jenkins。韋修平（1959）最早記錄我國大陸甘薯瘡痂病的發生情況。國內外對甘薯瘡痂病的研究主要集中在品種抗性鑒定、抗病育種和病害防治等方面（Smit et al.，1991; 黃實輝等，2011）。余文英等（2003，2005）研究了甘薯瘡痂病菌侵染對甘薯活性氧代謝和細胞超微結構等的影響。方樹民等（2004）篩選出甘薯瘡痂病高抗品種廣薯88-70和廣薯111。陳勝勇等（2014）研究發現50%硫磺·多菌靈可濕性粉劑500倍液對甘薯瘡痂病的防治效果最佳。Sumartini（2014）利用洋蔥（Allium cepa L.）提取物作為生物殺菌劑處理甘薯植株，能使甘薯瘡痂病病害強度降低70%～80%，使薯塊的重量和大小增加46%，防止產量損失達33%。【本研究切入點】目前我國對甘薯瘡痂病病原菌鑒定的研究較少，尚未發現對甘薯瘡痂病菌病原菌生物學特征等方面的系統鑒定，并缺乏對該病菌分子系統學方面的研究。【擬解決的關鍵問題】通過病原菌的形態特征觀察和致病力測定，結合核糖體內轉錄間隔區（ITS）、28S核糖體RNA（LSU）、RNA聚合酶II第二大亞基（rpb2）和翻譯延伸因子1-α（TEF1）部分序列的多核苷酸序列系統學分析等方法，對源于廣東的甘薯瘡痂病病原菌進行鑒定，從而明確廣東甘薯瘡痂病的病原菌種類及生物學和系統發育學特征，為甘薯瘡痂病防治及抗病育種提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 病害調查與樣品采集

2017年10月—2018年2月，對廣東省茂名和湛江等甘薯產區田間甘薯瘡痂病發生情況進行調查。在茂名和湛江各調查2塊田，采用五點取樣法，每個點隨機調查10株甘薯植株，計算甘薯瘡痂病的發病率。采集典型發病植株裝于牛皮紙信封中帶回實驗室分離備用。

1. 2 病原菌的分離與保存

在顯微鏡下觀察病斑部位病原菌的形態，用滅菌刀片切取約0.5 cm×0.5 cm大小且含有大量分生孢子的病斑表皮組織，置于裝有滅菌蒸餾水的1.5 mL離心管中，劇烈振蕩1 min，配制病原菌分生孢子懸浮液。采用分生孢子懸浮液梯度稀釋分離法（方中達，2007），吸取100 ?L稀釋的分生孢子懸浮液均勻涂布于含0.03%乳酸的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上，晾干后用Parafilm封口膜封口，置于25 ℃恒溫培養箱中培養7 d。挑取單一、粉紅色、表面褶皺的圓形或不規則形菌落接種于PDA培養基上，獲得純化的病原菌培養物。將純化的病原菌接種于SNA斜面培養基（1 L ddH2O中含1.0 g KH2PO4、1.0 g KNO3、0.5 g MgSO4·7H2O、0.5 g KCl、0.2 g葡萄糖、0.2 g蔗糖和15.0 g瓊脂粉）上，在25 ℃恒溫培養箱中培養30 d后，置于10 ℃培養箱中保存備用。

1. 3 病原菌形態觀察

1. 3. 1 菌落形態觀察和菌絲生長速度測定 選取在PDA培養基上培養20 d左右的代表性菌落，用直徑為5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊，接種于新的PDA培養基上（培養皿直徑為9 cm），用Parafilm封口膜封口后置于25 ℃恒溫培養箱中黑暗培養，觀察和記錄菌落形態。每株菌株設3個重復。

1. 3. 2 產孢細胞形態觀察和分生孢子大小測定

選取在25 ℃下PDA培養基上培養30 d的代表性菌落，用鑷子夾取菌落表面氣生菌絲，置于光學顯微鏡下觀察產孢細胞和分生孢子形態。選取在25 ℃下PDA培養基上培養30 d的菌落，用接種針在菌落表面刮取氣生菌絲置于裝有1 mL無菌水的離心管中，配制成分生孢子懸浮液。在顯微鏡下隨機選擇5個視野（400×），每個視野隨機選擇10個分生孢子，共計50個分生孢子，測量分生孢子大小。

1. 3. 3 發病植株組織上病原菌的顯微結構觀察

采集病原菌分生孢子懸浮液接種21 d后具有典型病斑的甘薯葉片和莖稈，送至武漢塞維爾生物科技有限公司制作石蠟切片，經甲苯胺藍染色后光學顯微鏡下觀察病原菌的顯微結構。

1. 4 病原菌致病性測定

1. 4. 1 活體植物接種 選取在PDA培養基上培養20 d左右的代表性菌落，用直徑為5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊轉接至100 mL馬鈴薯葡萄糖液體（PDB）培養基中，于25 ℃恒溫搖床（150 r/min）中培養21 d后，即可產生大量分生孢子。用滅菌擦鏡紙過濾去除菌絲，用血球計數板測定濾液中的分生孢子濃度，用PDB培養基調節分生孢子濃度為2×106個孢子/mL。使用噴壺（TaKaRa公司）將分生孢子懸浮液均勻噴灑至甘薯（品種：臺灣番薯）植株上部的4～5片葉片、嫩梢和莖稈上，每株菌株接種4株甘薯植株，每株植株上接種30 mL分生孢子懸浮液，以接種等體積的PDB培養基為對照。將接種后的植株置于室外薄膜大棚內。接種期間棚內溫度為20～25 ℃，定期噴水保持棚內空氣相對濕度>80%，每日觀察記錄甘薯植株發病情況。試驗重復2次。

1. 4. 2 甘薯塊根接種 使用噴壺將濃度為2×106個孢子/mL的分生孢子懸浮液噴灑于甘薯薯塊表面，以接種PDB培養基為對照，薯塊晾干后，置于塑料盒中于25 ℃溫室中保濕培養20 d，每日觀察記錄薯塊發病情況。試驗重復2次。

1. 5 ITS、LSU、rpb2和TEF1序列克隆與測序分析

選取在PDA培養基上培養20 d左右的代表性菌落，用直徑為5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊，接種到100 mL的PDB培養基中，于25 ℃恒溫搖床（150 r/min）中培養10 d后，用滅菌的定性濾紙過濾收集菌絲。菌絲經液氮研磨后，使用EasyPure? Plant Genomic DNA Kit（北京全式金生物技術有限公司）提取菌絲中基因組DNA，于-20 ℃保存備用。

分別使用引物對ITS1F/ITS4、LR0R/LR5、RPB2-5F2/fRPB2-7cR和elongation-1F/elongation-1R進行PCR，擴增ITS、LSU、rpb2和TEF1序列，引物（表1）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系50 ?L：Premix TaqTM（TaKaRa公司） 25 ?L，基因組DNA 3 ?L，10 ?mol/L上、下游引物各3 ?L，ddH2O 16 ?L。擴增程序：95 ℃預變性2 min;95 ℃ 45 s，退火45 s（ITS和LSU，48 ℃;rpb2，56 ℃;TEF1，60 ℃），72 ℃ 1.5 min，進行35個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。將獲得代表性菌株的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列進行BLASTn同源性比對，將序列提交NCBI/GenBank獲得基因登錄號。

1. 6 病原菌系統發育進化分析

下載GenBank中已公布的痂囊腔菌屬（Elsino?）代表性菌株的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列（表2），利用ClustalW對各目的序列進行比對分析，通過手工校正序列，將校正后的上述4個序列按照首尾相連方法拼接后進行多重比對分析后，使用MEGA 5.2進行聚類分析。以Myriangium hispanicum為外群，采用最大似然法和T92+G+I模型，構建多基因系統發育進化樹，以Bootstrap進行1000次重復檢驗，估算分支的自展支持率，分析其系統發育進化關系。

2 結果與分析

2. 1 甘薯瘡痂病的危害與癥狀特點

在廣東省湛江和茂名等地甘薯田間均發現甘薯瘡痂病，田間發病率為20.0%～37.5%。當環境溫度為20～30 ℃，濕潤多雨條件下該病害極易暴發流行。該病主要為害甘薯的葉片、葉柄和莖稈，從植株頂端的嫩葉和莖稈處開始發病，發病初期葉片和莖稈上形成淺褐色小病斑，后期葉片上病斑呈棕褐色不規則形，零星分布，莖稈和葉脈上病斑呈棕褐色凹陷，病斑橢圓形、長橢圓形或不規則形，葉脈上的病斑可導致葉片呈“屈膝狀”（圖1）。

2. 2 病原菌的培養特性及形態特征

從采集的甘薯瘡痂病病株樣品中共分離獲得26株單分生孢子分離物，在PDA培養基上25 ℃恒溫培養，26株單分生孢子分離物的菌落形態相似，無明顯差異。從中隨機選取3株菌株SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3作為代表性菌株，接種于PDA培養基上25 ℃恒溫進行培養特性觀察，結果顯示，3株菌株菌絲生長極慢，培養30 d后，菌落均呈花瓣狀、邊緣不整齊，菌落呈棕紅色，表面覆蓋少量或大量白色絨毛狀氣生菌絲，氣生菌絲致密，菌落直徑約2.5 cm，菌落反面均可觀察到棕紅色色素;培養275 d后，菌落仍不能覆蓋9 mm直徑培養皿，菌落呈棕紅色，表面覆蓋紅褐色或灰白色致密氣生菌絲，產生大量橙紅色色素分泌到菌落周圍的培養基中，菌落反面可見棕紅色色素，菌落下方培養基開裂（圖2）。

在光學顯微鏡下觀察SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3菌株的顯微結構，發現其產孢細胞透明，內生芽殖（圖3-A和圖3-B）;分生孢子單細胞，透明，短棒形，兩側頂端鈍圓，大小為6.1～9.0 ?m×2.2～3.0 ?m，平均大小為7.4 ?m×2.6 ?m（圖3-C）;發病植物組織處可見病原菌的分生孢子盤，內部著生分生孢子梗和分生孢子，分生孢子梗短棒狀（圖3-D），形態特征與Jenkins和Viegas（1943）描述的Sphaceloma batatas（E. batatas）基本一致。

2. 3 病原菌對甘薯的致病性測定結果

將3株代表性菌株SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3的病原菌分生孢子懸浮液接種到甘薯植株9 d后，甘薯植株頂端葉片和莖稈上開始出現針尖大小的淺棕褐色小病斑（圖4-A）。隨著保濕培養時間的延長，病斑逐步擴大、融合。20 d后，在接種病原菌的甘薯植株上部葉片正面、背面葉脈及莖稈上均產生病斑，葉脈和葉柄上的病斑呈棕褐色的疣狀瘡痂，濕度大時瘡痂呈紅褐色（圖4-B右）;葉片正面的病斑呈棕褐色圓形或多角形，病斑表面皺縮，周圍葉片變黃（圖4-D）;發病植株頂端嫩葉呈“屈膝狀”（圖4-C）。上述接種植株癥狀與田間癥狀表現一致。接種PDB培養基的對照植株健康生長，葉片和莖稈上未產生病斑（圖4-B左）。病原菌分生孢子懸浮液接種甘薯薯塊20 d后，薯塊上未產生明顯病斑。

2. 4 多基因核苷酸序列分析及同源性比對結果

為進一步明確廣東甘薯瘡痂病病原菌的分類地位，對3株代表性菌株SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3進行ITS、LSU、rpb2和TEF1序列擴增和測序，分別獲得長度為1010、878、910和389 bp的片段。BLASTn同源性比對分析結果表明，供試菌株的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列與痂囊腔菌屬（Elsino?）的E. ampelina、E. bidentis、E. arachidis、E. mimosae、E. ricini和E. sesseae等多個種的對應序列一致性為95%～99%，未比對出E. batatas的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列。將SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3菌株的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列提交至GenBank（登錄號見表2）。利用MEGA 5.2構建基于多個序列片段的系統發育進化樹。聚類分析結果（圖5）顯示，分離菌株與蓖麻痂囊腔菌（E. ricini）單獨聚成一支，其自展支持率為100%。

根據病原菌的形態和生物學特征及多核苷酸序列同源性比對結果，確定廣東甘薯瘡痂病的病原菌為甘薯痂囊腔菌（E. batatas）。

3 討論

本研究通過對分離自廣東省甘薯瘡痂病植株的代表性菌落、分生孢子、產孢細胞、分生孢子梗和分生孢子盤的形態特征觀察，采用柯赫氏法則進行驗證，鑒定其屬于痂囊腔菌屬真菌;并通過多核苷酸序列分析及系統發育比對分析，鑒定出廣東甘薯瘡痂病的病原菌為甘薯痂囊腔菌（E. batatas）。

痂囊腔菌屬[無性型為痂圓孢屬（Sphaceloma）]真菌作為植物病原菌具有廣泛的寄主范圍和地理分布，能侵染許多重要的經濟作物（柑橘和葡萄）、觀賞植物（一品紅）、大田作物（甘薯和大豆）和喬木（刺桐和歐洲榛），引起植物瘡痂病（Fan et al.，2017）。甘薯痂囊腔菌為害甘薯植株時，不侵染甘薯塊根，僅侵染甘薯地上部分的莖和葉片，在葉片正面、背面葉脈及莖稈上形成棕紅色的病斑，發病后期葉片卷縮、畸形，葉柄彎曲，呈“屈膝狀”，為害癥狀與前人研究報道（Sawada，1931;Goto，1937;Jenkins and Viégas，1943;黃實輝等，2011）一致。由于甘薯主要靠葉片進行光合營養積累，甘薯痂囊腔菌為害甘薯的莖和葉片，從而影響甘薯生長，造成減產。本研究明確了廣東甘薯瘡痂病的病原菌為甘薯痂囊腔菌，為甘薯瘡痂病的防治提供了科學依據。

由于痂囊腔菌屬真菌不同種間的菌落和分生孢子形態類似，需要結合形態學特征和分子生物學方法鑒定該屬真菌的分類地位（Fan et al.，2017）。本研究利用多核苷酸序列系統分析甘薯瘡痂病菌的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列，經BLASTn比對發現上述序列與蓖麻痂囊腔菌下多個種的序列一致性為95%～99%，但NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中沒有甘薯痂囊腔菌的任何基因信息。因此，本研究首次在NCBI數據庫中提交了甘薯痂囊腔菌的遺傳信息，通過系統發育分析發現甘薯痂囊腔菌與蓖麻痂囊腔菌的親緣關系最近。本研究為NCBI數據庫補充了甘薯痂囊腔菌的遺傳信息，為甘薯瘡痂病菌的鑒定提供重要參考依據。

劉奕君（2017）采用常規組織分離法從廣西發生甘薯瘡痂病典型癥狀葉片上分離獲得的病原真菌接種甘薯未見瘡痂病發病癥狀，未能分離到病原菌;此外，部分研究者發現通過常規組織分離法分離獲得的病原真菌接種甘薯不發病（結果未發表），表明采用常規組織分離法難以分離獲得甘薯痂囊腔菌。本研究發現，甘薯痂囊腔菌在PDA培養基上生長極其緩慢，在25 ℃下培養30 d后，菌落直徑僅為2.5 cm;培養9個月，菌落仍不能覆蓋直徑9 cm的培養皿。該菌極慢的生長速度是導致無法通過常規組織分離法獲得甘薯痂囊腔菌的原因。本研究通過普通光學顯微鏡及石蠟切片觀察，發現甘薯瘡痂病發病組織處產生大量的分生孢子，利用分生孢子懸浮液平板梯度稀釋法獲得大量甘薯痂囊腔菌的單分生孢子分離物。該方法操作簡單，能快速、高效地分離獲得發病甘薯組織處的痂囊腔菌屬真菌，為甘薯瘡痂病鑒定提供技術支撐。

4 結論

通過多核苷酸序列分析及同源性比對發現甘薯痂囊腔菌與蓖麻痂囊腔菌親緣關系最近，明確廣東甘薯瘡痂病的病原菌為甘薯痂囊腔菌。本研究為NCBI數據庫補充了甘薯痂囊腔菌的遺傳信息，為甘薯瘡痂病菌的鑒定提供重要參考依據。

參考文獻：

陳勝勇，李觀康，何靄如，余小麗，汪云. 2014. 不同藥劑對甘薯瘡痂病的防控效果[J]. 農學學報，4（6）：24-26. [Chen S Y，Li G K，He A R，Yu X L，Wang Y. 2014. Control efficiency of different pesticides on leaf scab disease of sweet potato[J]. Journal of Agriculture，4（6）：24-26.]

方樹民，柯玉琴，黃春梅，張銀杰. 2004. 甘薯品種對瘡痂病的抗性及其機理分析[J]. 植物保護學報，31（1）：38-44. [Fang S M，Ke Y Q，Huang C M，Zhang Y J. 2004. The evaluation of resistance and analysis of resistant mechanism of sweet potato varieties to leaf scab disease[J]. Acta Phytophylacica Sinica，31（1）：38-44.]

方中達. 2007. 植病研究方法[M]. 第3版. 北京：中國農業出版社：124-125. [Fang Z D. 2007. Plant disease research methods[M]. The 3rd Edition. Beijing：China Agriculture Press：124-125.]

黃實輝，黃立飛，房伯平，陳景益，張雄堅，李育軍，王章英，羅忠霞. 2011. 甘薯瘡痂病的識別與防治[J]. 廣東農業科學，（S）：80-81. [Huang S H，Huang L F，Fang B P，Chen J Y，Zhang X J，Li Y J，Wang Z Y，Luo Z X. 2011. Identification and control of sweet potato scab[J]. Guangdong Agricultural Sciences，（S）：80-81.]

劉翀，萬忠，楊亞慧. 2016. 2015年廣東甘薯產業發展形勢與對策建議[J]. 廣東農業科學，43（3）：17-20. [Liu C，Wan Z，Yang Y H. 2016. Development situation and countermeasures of Guangdong sweet-potato industry in 2015[J]. Guangdong Agricultural Sciences，43（3）：17-20.]

劉奕君. 2017. 甘薯真菌性病害調查及3種貯藏期病害的病原菌鑒定[D]. 南寧：廣西大學. [Liu Y J. 2017. Investigation of sweet potato fungal diseases and pathogenic identification of three fungal diseases in storage period[D]. Nanning：Guangxi University.]

韋修平. 1959. 土法防治甘薯瘡痂病[J]. 中國農業科學，（9）：14-15. [Wei X P. 1959. Control of sweet potato scab using traditional methods[J]. Scientia Agricultura Sinica，（9）：14-15.]

余文英，潘廷國，柯玉琴，艾育芳，阮妙鴻. 2003. 甘薯抗瘡痂病的活性氧代謝研究[J]. 河南科技大學學報（農學版），23（3）：1-6. [Yu W Y，Pan T G，Ke Y Q，Ai Y F，Ruan M H. 2003. Active oxygen metabolism of sweet potato under the stress of sweet potato scab[J]. Journal of Henan University of Science and Technology（Agricultural Scien-ce），23（3）：1-6.]

余文英，潘廷國，柯玉琴，王湘平，艾育芳，阮妙鴻. 2005. 不同抗性甘薯品種感染瘡痂病后的細胞超微結構[J]. 福建農林大學學報（自然科學版），34（2）：248-251. [Yu W Y，Pan T Q，Ke Y Q，Wang X P，Ai Y F，Ruan M H. 2005. Cell ultrastructure of different sweet potato varieties under the stress of sweet potato scab[J]. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University（Natural Science Edition），34（2）：248-251.]

Ames T，OSullivan J. 2014. Leaf and Stem Scab[EB/OL].（2014-03-26）. http：//keys.lucidcentral.org/keys/sweetpotato/key/Sweetpotato%20Diagnotes/Media/Html/TheProblems/DiseasesFungal/Scab/Scab.

Fan X L，Barreto R W，Groenewald J Z，Bezerra J D P，Pereira O L，Cheewangkoon R，Mostert L，Tian C M，Crous P W. 2017. Phylogeny and taxonomy of the scab and spot anthracnose fungus Elsino? （Myriangiales，Dothideomycetes）[J]. Studies in Mycology，87：1-41.

Gardes M，Bruns T D. 1993. ITS primers with enhanced speci-ficity for basidiomycetes-application to the identification of mycorrhizae and rusts[J]. Molecular Ecology，2：113-118.

Goto K. 1937. Outbreak of shoot scab of sweet potato in Amami Islands[J]. Annals of the Phytopathological Socie-ty of Japan，7：143-145.

Hyun J W，Yi S H，MacKenzie S J，Timmer L W，Kim K S，Kang S K，Kwon H M，Lim H C. 2009. Pathotypes and genetic relationship of worldwide collections of Elsino? spp. causing scab diseases of citrus[J]. Phytopathology，99：721-728.

Jenkins A E，Viégas A P. 1943. Stem and foliage scab of sweet potato[J]. Journal of the Washington Academy of Sciences，33：244-249.

Liu Y J，Whelen S，Hall B D. 1999. Phylogenetic relationships among ascomycetes：Evidence from an RNA polymerse II subunit[J]. Molecular Biology and Evolution，16（12）：1799-1808.

Rehner S A，Samuels G J. 1994. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences[J]. Mycological Research，98（6）：625-634.

Sawada K. 1931. Descriptive catalogue of the Formosan fungi V[J]. Report of the Department of Agriculture Go-vernment Research Institute of Formosa，51：105.

Smit N E J M，Holo T，Wilson J E. 1991. Sweet potato seedling test for resistance to leaf scab disease（Elsino? batatas）[J]. Tropical Agricuture，68：263-267.

Sumartini. 2014. Efficacy of onion（Allium cepa L.） extract as a biofungicide to control scab disease（Sphaceloma batatas） of sweet potato（Ipomoea batatas）[J]. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences，2（4）：397-402.

Sung G H，Sung J M，Hywel-Jones N L，Spatafora J W. 2007. A multi-gene phylogeny of Clavicipitaceae（Ascomycota，Fungi）：Identification of localized incongruence using a combinational bootstrap approach[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，44（3）：1204-1223.

Vilgalys R，Hester M. 1990. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species[J]. Journal of Bacteriology，172（8）：4238-4246.

White T J，Bruns T，Lee S，Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In：PCR Protocols：A guide to methods and applications（Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，White T J，eds）[M]. San Diego，California，U.S.A.：Academic Press：315-322.

（責任編輯 麻小燕）