松木層孔菌的液化與紅外光譜分析

林思琪 陳佳敏 翁詩曼 吳思敏 黃耿昌 盧超文 朱峰 陳忻 曾飛

摘要：【目的】優化苯酚—硫酸法液化松木層孔菌的工藝參數，分析液化前后松木層孔菌化學官能團變化，揭示其液化機理，為廢棄松木層孔菌的高效利用開辟一條新途徑。【方法】以松木層孔菌為原料、濃硫酸為催化劑、苯酚為液化劑，考察料液比（原料/苯酚）、液化溫度、液化時間和催化劑用量對松木層孔菌液化率的影響，并通過紅外光譜對松木層孔菌原料和液化殘渣進行分析。【結果】4個因素對松木層孔菌液化率影響排序為料液比>液化時間>催化劑用量>液化溫度，優化的液化工藝參數為：料液比1∶6、液化溫度170 ℃、液化時間75 min、催化劑用量0.30 g，在此條件下，松木層孔菌液化率為48.64%。液化前后松木層孔菌紅外光譜特征峰的形狀和吸收位置均發生明顯變化，3366 cm-1的活潑氫吸收峰在液化后發生紅移，酰胺羰基吸收峰則分別由1697和1657 cm-1移至1701 cm-1，由1554 cm-1移至1612和1512 cm-1。【結論】采用苯酚—硫酸法可有效液化松木層孔菌，松木層孔菌含氮主要成分幾丁質發生脫乙酰化反應，液化產物含有大量酚類物質，可進一步用于制備高附加值化工產品，為高等真菌菌渣的綜合利用開辟新途徑。

關鍵詞： 松木層孔菌;幾丁質;苯酚—硫酸法;液化;紅外光譜

0 引言

【研究意義】將木材、秸稈等生物質資源有效液化得到化工原料和生物燃油，是減少環境污染和緩解化石能源危機的一種重要生物質資源利用手段（Jiang et al.，2018;Kim et al.，2019;Zhao et al.，2019）。常見的液化劑有苯酚、多元醇和環狀碳酸酯，其中苯酚—硫酸法由于液化條件溫和，液化效果較好，已被廣泛應用于玉米秸稈、木薯稈等多種生物質資源的液化（莫引優等，2013;唐賢明等，2014）。在長期對食藥用菌資源的研究開發過程中，本課題組發現，來自蘑菇種植業和制藥業等產業的食藥用菌菌渣利用率極低，除了部分進行堆肥還田處理或作為動物飼料外，大多數菌渣被隨意丟棄，造成嚴重的環境污染（岑婉瑩等，2016;盧衛紅等，2017;朱峰等，2017）。因此，迫切需要開發新的技術對這些廢棄菌渣資源進行高效利用。【前人研究進展】幾丁質是大多數真菌細胞壁的主要成分（邢來君和李明春，1999），也是蝦殼、蟹殼等的主要成分，已有學者研究幾丁質在不同條件下的液化情況。Pierson等（2014）報道，在硫酸催化下，幾丁質在160 ℃乙二醇中液化90 min后，75%被液化，生成的主要產物是羥基乙基-2-氨基-2-脫氧吡喃糖苷和羥基乙基-2-乙酰氨基-2-脫氧吡喃糖苷;Zhang和Yan（2016）利用蟻酸在100 ℃下液化幾丁質12 h，液化率可達60%;經長時間液化后，液化產物可轉化為5-甲酰氧基甲基糠醛，產率35%。為擴大漁業廢棄資源的應用范圍，Zhang等（2018）將球磨幾丁質在聚乙二醇400/甘油混合溶劑中液化成多元醇，并進一步與聚乙烯醇共混制備得到抗菌活性顯著改善的共混膜;Zheng等（2018）則以硫酸為催化劑，將球磨幾丁質在160 ℃的二乙二醇中液化120 min，液化產物進一步與聚乙烯醇混合制備得到共混膜，并將其應用于廢蝦殼的液化。目前將液化技術應用于高等真菌的研究較少。Jasiunas等（2017）研究發現，將廢蘑菇培養土與山楊木混合進行酸浸共液化，可降低殘渣率，但單獨將廢蘑菇培養土浸泡液化則無效;Durak（2018）通過超臨界熱解技術將云芝轉化為生物油、生物炭和氣體產物，研究發現催化劑和溫度對云芝的超臨界熱解產物具有重要影響。【本研究切入點】擔子菌松木層孔菌[Phellinus pini（Thore：Fr.） Ames]是木層孔菌屬高等真菌，具有抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性（Zhu et al.，2017），但目前尚未見有關松木層孔菌菌渣利用的研究報道。【擬解決的關鍵問題】將苯酚—硫酸法應用于松木層孔菌的液化，研究料液比（原材料/苯酚）、液化溫度、液化時間和催化劑用量對液化率的影響，并通過紅外光譜對液化殘渣進行分析，旨在為廢棄松木層孔菌的高效利用開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

松木層孔菌采自廣東省佛山市南海區崗山，風干后粉碎過40目篩，105 ℃烘干至恒重備用（未經提取利用的松木層孔菌粉末）。苯酚、濃硫酸和甲醇均為市售分析純試劑。主要儀器設備：DF-101S恒溫磁力攪拌器（上海力辰儀器科技有限公司）、IR Tracer-100傅里葉紅外光譜儀（日本島津公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 松木層孔菌成分分析 根據國家標準GB/T 35818—2018測定松木層孔菌抽提物、灰分和木質素含量。采用重鉻酸鉀氧化法（唐國濤等，2012）測定樣品中纖維素含量。

1. 2. 2 松木層孔菌液化 準確稱取一定量松木層孔菌粉末加入標口錐形瓶中，然后加入一定量苯酚和濃硫酸，放入攪拌子，置于已預熱至預設溫度的油浴鍋中，套上球形冷凝管，接通循環冷凝水，開動攪拌，液化反應一定時間后，立即用已干燥至恒重的G2濾器抽濾，甲醇充分洗滌殘渣至濾液無色為止。G2濾器和殘渣一并放入105 ℃烘箱烘干至恒重，計算液化率。

液化率=（松木層孔菌質量-殘渣質量）/松木層

孔菌質量×100

1. 2. 3 單因素試驗

1. 2. 3. 1 液化溫度選擇 固定料液比1∶5（松木層孔菌粉末4.00 g，苯酚20.00 g）、催化劑（濃硫酸）用量0.20 g、液化時間60 min，分別在液化溫度為130、140、150、160和170 ℃的條件下對松木層孔菌粉末進行液化。

1. 2. 3. 2 催化劑用量選擇 固定料液比1∶4（松木層孔菌粉末4.00 g，苯酚16.00 g）、液化時間60 min、液化溫度150 ℃，分別在催化劑用量為0.10、0.20、0.30、0.40和0.50 g的條件下對松木層孔菌粉末進行液化。

1. 2. 3. 3 料液比選擇 固定松木層孔菌粉末用量4.00 g、液化時間60 min、液化溫度150 ℃、催化劑用量0.20 g，液化劑苯酚用量分別為16.00、20.00、24.00、28.00和32.00 g，即在料液比分別為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7和1∶8的條件下對松木層孔菌粉末進行液化。

1. 2. 3. 4 液化時間選擇 固定料液比1∶4（松木層孔菌粉末4.00 g，苯酚16.00 g），催化劑用量0.20 g，液化溫度150 ℃，分別在液化時間為30、45、60、75和90 min的條件下對松木層孔菌粉末進行液化。

1. 2. 4 正交試驗設計 在單因素試驗基礎上，設計4因素（料液比、液化溫度、液化時間和催化劑用量）3水平正交試驗，優化松木層孔菌液化工藝條件。正交試驗因素及水平見表1。

1. 2. 5 松木層孔菌及其液化殘渣的紅外光譜分析

采用紅外光譜儀對松木層孔菌粉末和液化殘渣進行分析，溴化鉀壓片，掃描范圍4000～450 cm-1。

1. 3 統計分析

采用OriginPro 9.1進行方差分析和多重比較，使用Excel 2013制圖。

2 結果與分析

2. 1 松木層孔菌成分分析結果

成分分析結果表明，松木層孔菌的木質素含量高達46.03%，纖維素含量為15.36%，灰分含量為5.64%，抽提物（脂溶性物質）含量為6.84%。

2. 2 單因素試驗結果

2. 2. 1 液化溫度對松木層孔菌液化率的影響 從圖1可看出，隨著液化溫度升高，松木層孔菌液化殘渣越少;液化溫度升至160 ℃時，液化率達峰值（47.69%）;之后，隨著液化溫度繼續升高，液化率反而降低。其原因可能是隨著液化溫度升高，松木層孔菌的主要成分木質素、纖維素、葡聚糖和幾丁質等大分子化合物開始迅速分解，液化效果明顯，但升至160 ℃高溫后，由于液化體系中產生大量的自由基，自由基與自由基之間、自由基與底物之間又發生縮聚反應產生新的高分子重新聚集，使得液化率降低，殘渣增加。因此，液化溫度選擇160 ℃為宜。

2. 2. 2 催化劑用量對松木層孔菌液化率的影響

從圖2可看出，隨著催化劑濃硫酸用量增加，松木層孔菌液化率迅速上升，當催化劑用量為0.30 g時，液化率達最大值（42.54%）;之后繼續增加催化劑用量，液化率反而下降。其原因可能是隨著催化劑用量增加，加速了松木層孔菌中大分子的分解反應，但催化劑用量超過0.30 g，過多的濃硫酸使反應體系產生大量的碳正離子活潑中間體，碳正離子進一步進攻底物發生聚合反應，產生新的大分子重新聚集，導致殘渣質量增加，液化率反而下降。因此，選擇催化劑用量0.30 g為宜。

2. 2. 3 料液比對松木層孔菌液化率的影響 從圖3可看出，當料液比由1∶4降至1∶5后，松木層孔菌液化率迅速上升到39.68%;隨著液化劑苯酚用量繼續增加，料液比達1∶5后，液化率繼續上升，但上升趨勢變緩。原因是液化劑苯酚用量的增加可促使松木層孔菌中大分子的分解反應向正方向進行，同時，過量的液化劑起著溶劑化作用，可部分阻止分解反應產生的自由基、碳正離子等活潑中間體進一步與底物發生聚合反應;但當料液比達1∶5后，松木層孔菌大分子的分解反應趨于平衡，因此，繼續增加液化劑苯酚用量，液化率上升不明顯。因此，為了節省成本，選擇料液比1∶5為宜。

2. 2. 4 液化時間對松木層孔菌液化率的影響 從圖4可看出，隨著液化時間的延長，松木層孔菌液化率逐漸上升，但液化60 min后，液化率上升趨勢有所減緩。總體來說，延長液化時間，有利于松木層孔菌的液化。

2. 3 松木層孔菌液化正交試驗結果

由表2可知，4個因素對松木層孔菌液化率影響依次為料液比>液化時間>催化劑用量>液化溫度。濃硫酸催化苯酚液化松木層孔菌的最優參數組合為A3B3C3D2，即料液比1∶6、液化溫度170 ℃、液化時間75 min、催化劑用量0.30 g，在此工藝條件下進行驗證，得到松木層孔菌液化率為48.64%。

2. 4 松木層孔菌液化前后紅外光譜分析結果

通過紅外光譜儀對采用優化工藝液化松木層孔菌后的殘渣和液化前松木層孔菌粉末進行分析，得到紅外光譜圖（圖5）。從圖5可看出，與液化前的紅外光譜圖相比，松木層孔菌液化殘渣的紅外光譜發生明顯變化。液化前松木層孔菌紅外光譜中3366 cm-1的活潑氫（O-H鍵和N-H鍵）伸縮振動吸收峰在液化后發生紅移，明顯變寬，并且覆蓋了樣品中飽和C-H鍵的伸縮振動吸收峰（2924 cm-1），提示液化殘渣中大分子的活潑氫有相當一部分是以締合形式存在。液化前，松木層孔菌1697和1657 cm-1處是酰胺Ⅰ帶特征吸收峰;液化殘渣的羰基特征峰則出現在1701 cm-1，提示液化殘渣中可能存在解聚后重新聚合生成的醛酮類聚合物，也可能是多糖降解產物5-羥基糠醛自身聚合或與苯酚反應形成的一種高分子化合物。液化前酰胺Ⅱ帶特征峰1554 cm-1在液化后的殘渣中出現在1612和1512 cm-1。羥基和氨基紅移現象及酰胺Ⅰ帶和Ⅱ帶藍移現象，有可能是因為松木層孔菌中大分子解聚后生成的分子重新聚合并通過氫鍵締合在一起所導致。液化前松木層孔菌β-葡聚糖的振動吸收特征峰1041 cm-1，在液化殘渣中則出現在1171、1109和1036 cm-1;在多糖C-O鍵和C-O-C鍵為主的指紋特征區（900～450 cm-1），液化前后變化也非常明顯。

3 討論

據報道，靈芝多孔菌含有高達70%以上的纖維素和木質素（王松華等，2013），而本研究的成分分析結果表明松木層孔菌中木質素含量為46.03%，纖維素含量為15.36%，灰分含量為5.64%，抽提物（脂溶性物質）含量為6.84%。可見不同菌種的化學組成雖然不同，但纖維素和木質素含量均很高。擔子菌松木層孔菌是一種木腐真菌，通過分泌酶將纖維素和木質素降解為自身細胞壁主要成分葡聚糖（α和β-1，3）、幾丁質、甘露聚糖和蛋白質等大分子（李明月等，2012）。因此松木層孔菌的液化，除了需要將主要成分纖維素和木質素液化之外，還需要液化葡聚糖、幾丁質、甘露聚糖和蛋白質等大分子。幾丁質又稱甲殼素，是以β-1，4-N-乙酰氨基葡萄糖為單元的無支鏈多糖，對幾丁質液化的研究表明，幾丁質在液化時首先會發生脫乙酰化（Pierson et al.，2014）。動力學研究表明幾丁質的酸催化液化為復雜的多級反應（張潔等，2017）。許文茸等（2018）在對幾丁質液化研究的基礎上，綜述了幾丁質在不同液化劑中的液化機理，表明用不同液化劑對幾丁質進行液化，其液化產物不同，液化機理也不盡相同。

本研究以濃硫酸為催化劑、苯酚為液化劑，在一定液化溫度下液化一定時間，可將松木層孔菌進行液化。從單因素試驗結果可看出，料液比、液化溫度、液化時間和催化劑用量等因素對松木層孔菌液化率的影響均較大，尤其延長液化時間和增加液化劑用量可提高松木層孔菌液化率，但當料液比達1∶5和液化60 min后，液化率上升趨勢變緩。正交試驗結果顯示，料液比對松木層孔菌液化率的影響最大，其次為液化時間，催化劑用量和液化溫度的影響相對較小，優化得到的液化工藝參數為料液比1∶6、液化溫度170 ℃、液化時間75 min和催化劑用量0.30 g，但在該工藝條件下，松木層孔菌總體液化率不高，未能超過50%，液化效果相當于張潔等（2017）以濃硫酸催化乙二醇液化幾丁質的液化效果（殘渣率51.7%）。不同于張潔等（2017）以純幾丁質為液化材料，本研究的液化材料為含有高含量幾丁質的松木層孔菌子實體。分析液化率不高的原因：一方面可能是由于松木層孔菌細胞壁主要成分是葡聚糖、幾丁質和甘露聚糖等難以被液化的多糖;另一方面可能是松木層孔菌主要成分被液化后重新聚合生成較多的沉淀產物。

分析松木層孔菌液化前后紅外光譜圖可知，松木層孔菌液化殘渣中羥基、氨基和酰胺羰基等官能團特征峰的形狀和位置均發生了顯著變化，說明松木層孔菌中的葡聚糖、幾丁質和甘露聚糖等多糖在液化時發生解聚反應生成新產物。結合許文茸等（2018）總結的幾丁質液化機理，可證明松木層孔菌含氮主要成分幾丁質發生了脫乙酰化反應。由于液化殘渣是由多種物質組成的混合物，紅外光譜分析只能判斷出該混合樣品中特征官能團是否發生變化，無法分析出具體化學成分組成，因此，只能初步揭示松木層孔菌液化機理。苯酚—硫酸法常壓催化液化纖維素首先發生纖維素的降解生成葡萄糖和5-羥甲基糠醛，再進一步與液化劑苯酚反應生成各種小分子產品。幾丁質的降解機理與纖維素相似，1，4-糖苷鍵斷裂生成單糖苷，但不同的是幾丁質含有的乙酰氨基進一步脫乙酰化得到氨基葡萄糖，再轉化生成各種小分子。下一步需對松木層孔菌液化殘渣和離子液體化學成分進行分析，通過氣相色譜—質譜聯用、液相色譜—質譜聯用和核磁共振波譜等技術對液化產物進行分析，鑒定液化產物分子結構，以進一步揭示松木層孔菌的液化機理。

此外，由于松木層孔菌含有大量木質素，木質素降解后得到許多酚類小分子，同時用苯酚為液化劑，液化產物會有過量的苯酚存在，因此，可利用酚類化合物的特點，將液化產物進行酚醛縮合反應制備得到各種酚醛樹脂、環氧樹脂等化工產品，拓展液化產物的高值化利用，也可為高等真菌菌渣的綜合利用開辟一條新途徑。

4 結論

采用苯酚—硫酸法可有效液化松木層孔菌，且延長液化時間和增加液化劑用量均有利于液化反應。在催化劑濃硫酸和液化劑苯酚共同作用下，松木層孔菌含氮主要成分幾丁質發生脫乙酰化反應，液化產物含有大量酚類物質，可進一步與甲醛縮合制備成酚醛樹脂或與環氧乙烷縮合制備成環氧樹脂，具有較高推廣應用價值。

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（責任編輯 羅 麗）