灰霉菌侵染對番茄幼苗活性氧積累及抗氧化酶活性的影響

何 娟，潘光軍，官涵杰，陸光磊，陳江艷，須 文

（貴州大學農學院園藝系，貴州 貴陽 550025）

灰霉病是由葡萄孢屬（Botrytisspp.）真菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的真菌性病害，在我國各蔬菜種植區均有發生，造成巨大的經濟損失[1]。番茄（Solanum lycopersicumL.）是世界第一大蔬菜作物，根據世界糧農組織統計顯示，全球每年番茄總產值接近1 000億美元，在蔬菜和水果中居于首位。番茄在種植過程中容易發生多種病害，主要有早疫病、青枯病、晚疫病、病毒病、灰霉病、線蟲病、細菌性斑點病等。隨著番茄種植面積的不斷擴大以及連作，番茄病害發生加重，而且是多種病害同時發生，給防治加大了難度。番茄灰霉病是造成保護地番茄減產的主要原因之一[2]，目前生產上主要以農藥防治為主，但存在著農藥殘留及環境污染的問題。

植物體內的可溶性蛋白是指存在于細胞中的由多種酶系構成的非膜結合蛋白體系，可以以小分子狀態溶于水或其他蛋白，大多數是參與各種代謝的酶類，其含量是了解植物總體代謝的一個重要指標。在植物遭受鹽害、低溫、高溫、干旱等逆境時，都以可溶性蛋白的含量高低為指標，是植物產生抗性基因最直觀的鑒定指標。

活性氧（ROS）迸發被認為是過敏反應的特征性反應，可以由生物或者非生物因素誘發，也是植物對病原菌應答的最早期反應之一，在植物的防衛反應中起到重要的作用[3-4]。ROS本身作為一個信號分子，可以直接或間接地激活抗性基因和植物防衛基因的表達，從病原菌開始侵染植株到植物獲得系統獲得性抗性（SAR），這實質是一個連續的信號傳遞過程[5]。ROS作為這個信號鏈上的一個信號參與SAR的形成。此時，ROS可能起到雙重作用，其在高濃度時對植物起到傷害作用，低濃度時起到傳遞信號作用，并且誘導植物體內抗性基因和防衛基因的表達[6]。研究發現ROS作為信號分子，在諸如植物生長、發育、激素信號等過程中也起到重要的作用[7]。

在植物體中均有活性氧產生和清除的機制。植物體內存在能夠分解ROS的酶系以及多種生物抗氧化劑，共同組成了一個ROS防御體系[8]，使ROS的產生與清除處于一種動態平衡狀態，保護機體正常細胞組織免受破壞。在植物體內發生ROS迸發后，酶系統行使對ROS的清除作用，在這其中起主要作用的是超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸/谷胱甘肽循環酶系統、谷胱甘肽過氧化物酶系統、硫氧還蛋白系統。SOD是植物代謝的關鍵酶之一[9]。非酶促清除系統主要是指植物體內所含的抗氧化物質。目前，發現植物體內抗氧化物質主要包括抗壞血酸、維生素E、卟啉類化合物、類胡蘿卜素、酚類化合物、甘露醇及還原性谷胱甘肽等[10]。這些物質既可直接在消除ROS中起作用，又可作為酶的底物在活性氧的清除中發揮重要作用。逆境脅迫能夠促進植物自身合成褪黑素。褪黑素廣泛存在于植物體內，對植物生長和發育方面有著重要的作用[11]。

本試驗以番茄幼苗為試驗材料，比較番茄幼苗受灰霉菌侵染后的葉片超氧陰離子自由基活性氧成分以及抗氧化酶、內源褪黑素等的變化，為進一步分析活性氧和抗氧化防御系統在番茄的抗病信號調控機制中的作用，提高產量和品質提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為番茄品種浙雜809，購于浙江浙農種業有限公司。供試番茄灰霉菌由浙江大學蔬菜研究所師愷教授惠贈。

1.2 試驗設計

試驗設置2個處理：番茄幼苗接種灰霉病菌菌液處理（記為灰霉菌），以番茄幼苗接種純凈水為對照處理（記為CK）。

1.3 試驗方法

1.3.1 幼苗培養

試驗在貴州大學農學院園藝專業基礎實驗室進行。番茄種子溫湯浸種15 min后冷卻至室溫，繼續浸種12 h，然后置于28 ℃的恒溫箱中催芽，中間翻動種子2～3次，2～3 d種子露白后，將發芽的番茄種子播種在草炭、蛭石和珍珠巖體積比為3∶1∶1的混合基質中。當番茄幼苗長至2葉1心時，移苗至裝有同樣基質的塑料營養缽中，每缽1株。生長環境條件如下：溫度為25 ℃/20 ℃（白天/晚上），相對濕度控制在70%左右，光周期為14 h/10 h（光/暗）、平均光強約300 μmol/（m2·s）。每3 d用“N-P2O5-K2O+TE”為“20-20-20+TE”的水溶肥稀釋1 000倍后澆灌幼苗。當幼苗4葉1心時進行活體接種灰霉菌處理。

1.3.2 樣品處理、采集與測定

番茄長到4葉1心時，選取生長健康、長勢一致的番茄幼苗進行灰霉菌接種。接種方法是用濃度為2×105cfu/mL的灰霉菌孢子懸浮液進行葉面、主莖部位均勻噴施，以空白懸浮液作為對照，每處理20株番茄。試驗設重復3次。接種后保持空氣濕度90%以上，分別于接種后1、2、3 d觀察植株發病表型并取樣測定葉片灰霉病菌含量、活性氧、抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量等。取樣時取植株上層成熟完整葉片，混合取樣。

1.3.3 測定方法及原理

植株發病表型：灰霉Actin的相對表達量是一個能表征番茄葉片中灰霉病菌含量的指標，Actin基因前引物序列為：ACTCATATGTTGGAGATGAAGCGCAA；后引物序列為：AATGTTACCATACAAATCCTTACGGACA。以番茄Actin基因表達水平作為內參，相對基因表達水平的計算參照Livak[12]的方法計算。

可溶性蛋白的含量使用牛血清蛋白作為標準，測定方法參考Bradford[13]的方法。SOD、POD、CAT和谷胱甘肽還原酶（GR）的測定方法參考Xia等[14]的方法。使用紫外分光光度計進行吸光度（OD值）的測定分析。褪黑素的含量測定采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA法）。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，計算樣品濃度。超氧陰離子自由基（O2-·）產生速率的測定采用羥胺氧化法[15-16]。

1.3.4 數據分析

利用Excel 2010、DPS和Origin軟件進行試驗數據的統計、整理、分析和做圖。

2 結果與分析

2.1 灰霉菌侵染后的番茄幼苗葉片表型變化分析

由侵染觀測結果可知，番茄幼苗接種灰霉菌孢子懸浮液1 d后葉片表面可以看到少量棕褐色病斑點，2 d后葉尖部區域開始出現明顯的點狀黑褐色病斑，有明顯的水浸狀。侵染3 d后番茄整個葉片出現大量棕褐色斑點，極其明顯。對照處理無明顯表型變化。試驗表明，接種灰霉病菌后，番茄植株下部葉片稍黃于對照處理的植株下部的葉片，葉柄處多處有不規則褐色病斑。隨著侵染后時間的延長，病斑斑點逐漸增多，葉色逐漸變淺。

2.2 番茄葉片的灰霉菌含量變化分析

灰霉Actin的相對表達量是一個能表征番茄葉片中灰霉病菌含量的指標。由圖1可知，在灰霉菌侵染后，番茄葉片的灰霉菌含量隨時間的延長而增多，侵染2、3 d的葉片灰霉菌含量分別是侵染1 d的3.1、5.9倍。葉片灰霉病菌含量的變化與葉片發病表型相一致。

2.3 番茄葉片的可溶性蛋白含量變化分析

結果表明：番茄葉片可溶性蛋白的含量在灰霉菌侵染后3 d內有所增加，但是新復極差比較發現，灰霉菌侵染各處理之間可溶性蛋白的含量沒有顯著差異，如圖2所示。

2.4 番茄葉片O2-·的含量變化分析

在環境脅迫下，細胞內生物自由基代謝平衡被破壞，造成O2-·積累，進而引發或加劇膜脂過氧化作用，使得細胞膜系統的結構和功能劣變，新陳代謝發生紊亂。如圖3所示，番茄幼苗受到灰霉病菌侵染后O2-·的含量增加，侵染后3 d葉片O2-·的含量達到1.6 nmol/mg，是對照的2.9倍?；钚匝鮋2-·加劇細胞膜損傷，破壞DNA、蛋白質和脂類等分子結構。

2.5 番茄葉片抗氧化酶活性分析

如圖4所示，番茄幼苗受到灰霉病菌侵染后1 d葉片SOD活性顯著減小，為4.0 U/mg，只達到對照的71.25%。而侵染2 d后幼苗葉片SOD活性又顯著增大，與對照一致。侵染后第3天葉片SOD活性又有所下降，但是沒有達到顯著水平。受到灰霉病菌侵染2 d后番茄幼苗葉片的POD活性繼續下降，達到0.22 U/mg，是對照的56.7%。隨著灰霉病菌侵染后時間的延長，葉片POD活性繼續下降，對照處理的葉片POD活性小幅下降（圖5）。受到灰霉病菌侵染后番茄幼苗葉片CAT活性顯著高于對照，侵染后1、3 d葉片CAT活性分別是0.04、0.05 μmol/（mg·min），分別是對照的1.86倍和1.56倍，但新復極差檢驗結果表明，兩者之間差異并不顯著（圖6）。受到灰霉病菌侵染后番茄幼苗葉片GR活性顯著高于對照，侵染后1、2、3 d葉片GR活性之間差異顯著，分別達到0.19、0.25、0.40 μmol/（mg·min），分別是對照的1.17、1.58、2.55倍（圖7）。上述結果說明，灰霉菌侵染引起的生物脅迫并不一定導致SOD、CAT和POD 活性的上升，不能以此來判斷植物對逆境的響應能力和抗逆境能力的強弱。

2.6 番茄葉片的褪黑素含量分析

如圖8所示，番茄幼苗在接種灰霉病菌后1 d葉片褪黑素含量增加，但是隨著時間的延長，褪黑素含量不再顯著增加。侵染后1 d葉片褪黑素含量是15.5 ng/g，是對照的1.1倍，侵染后3 d葉片褪黑素含量是15.8 ng/g，是對照的1.08倍。由此可知，褪黑素作為一種抗氧化物質，在番茄幼苗受到灰霉菌侵染的早期被誘導增加，有助于清除活性氧。

3 結論與討論

在本試驗中，灰霉菌侵染后葉片O2-·積累增多，CAT和GR的活性是升高的，其變化趨勢與SOD、POD是不同的。由此可以說明，灰霉菌侵染引起的生物脅迫不能簡單地根據SOD、CAT和POD 的活性值絕對高低來判斷植物對逆境的響應能力和抗逆境能力的強弱；但是在脅迫條件下，如果能提高植物的保護酶系統活性，清除活性氧自由基的能力增強，就能減輕傷害。

綜合以上結果得出：番茄幼苗受到灰霉菌侵染后植株逐漸發病，葉片病斑逐漸增多，體內超氧陰離子自由基等活性氧爆發，SOD和POD活性下降，CAT和GR活性上升，抗氧化物質褪黑素含量增加，上述變化都是番茄幼苗為了抵御灰霉菌的生物脅迫而發生的應激反應，但不是所有抗氧化酶活性都升高。所以植物在遭受病原菌等生物脅迫時不能簡單地推斷SOD、CAT和POD等抗氧化酶活性一定升高，植物抵御病原菌侵染更多地依賴于抗性信號路徑中信號物質的激活和積累。