基于UHPLC-MS/MS法，中毒量氯化琥珀膽堿在大鼠體內分布的研究

盛 潔，姜 榮，文繼月，陳 林，解啟文，方俊杰，萬 陽，秦 明，李 婧，陳冠軍，陳志武

(1.安徽醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，安徽，合肥 230032；2.安徽省公安廳物證鑒定中心，安徽 合肥 230061；3.安徽醫科大學科研實驗中心，安徽 合肥 230032)

氯化琥珀膽堿(succinylcholine chloride，Suc)又稱司可林、氯化琥珀酰膽堿等，化學名為二氯化2,2′-[(1,4-二氧代-1,4-亞丁基)雙(氧)]雙[N,N,N-三甲基乙銨]二水合物。Suc在臨床上用作為手術時的肌肉松弛劑，但若超量注射或在無呼吸機配合使用的情況下，可致患者呼吸麻痹，甚至死亡[1]。因此，Suc不僅是一種藥物，還是一種有毒化學品，危險類別為6.1 (b)[2]。近年來，犯罪分子將Suc用于飛鏢射殺家禽、家畜類動物，甚至用作射殺人的毒藥[3]。因此，快速、準確地檢測出體內的Suc成為當今司法實踐中的一個新課題。

目前，檢測Suc有高效液相色譜法[4]、氣相色譜質譜聯用法[5]，離子色譜法[6]、酶電極法[7]等方法，這些方法雖可準確地檢測體外的Suc，但Suc一旦進入體內被很快代謝分解成膽堿和琥珀酸，大約只有2%以原形存在，濃度極低，而且代謝產物膽堿也可由體內的乙酰膽堿分解產生，琥珀酸也是機體中的一種內源性物質[8]，這些檢測方法難以進行體內的Suc中毒的鑒定且靈敏度較低；或者采用柱后反應生成膽堿過氧化物的衍生化方法，但過程較為復雜[9]。目前主流方法側重于液相色譜質譜聯用法[10]。本研究根據Suc的理化性質和結構特征建立了專屬于Suc的超高效液相色譜-質譜法(ultra high performance liquid chromatography-tandem massspectrometry, UHPLC-MS/MS)[11]，為了提高分析測定的精密度和準確度，采用Oasis WCX固相萃取柱進行純化檢測樣品；為了提高方法的靈敏度和檢測速度，選擇Phenomene Luna NH2柱進行樣品的色譜分離。按照分析方法驗證要求，對上述方法進行了嚴格的方法學確證，相較于現有的檢測手段，該方法能快速、準確地測定Suc中毒大鼠體內的藥量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1儀器 30AD超高效液相色譜系統(DGU-20A5R在線真空脫氣機、LC-30AD泵、SIL-30AC自動進樣器、CBM-20A系統控制器、CTO-20AC色譜柱柱溫箱)，由日本島津(SHIMADZU)公司出品；TRIPLE QUADAPTM5500三重四極桿質譜儀，由美國AB公司出品。

1.1.2藥品與試劑 Suc，為白色結晶性粉末，購自上海藥明康德新藥開發有限公司，批號：ES8621-4-P1，純度為99%；乙腈和甲醇，購自美國Sigma公司，均為色譜純，批號分別為WXBC7599V和WXBC7987V，純度為98%；甲酸，購自北京百靈威科技有限公司，為色譜純，批號：L240T13，純度為98%；5%氨水，購自合肥英博生物有限公司，批號：20180501。

1.1.3實驗動物 健康SD大鼠(清潔級)，♂，體質量(180～220)g，全部是安徽醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為scxk(皖)2017-001，實驗室內飼養溫度為(22±3) ℃。

1.2 實驗方法

1.2.1Suc中毒大鼠的制備 大鼠背部脫毛后，隨機分成生理鹽水 (NS) 對照組、Suc 0.75、1.5和3.0 mg·kg-13個劑量組，共4組，每組6只大鼠。各組大鼠分別皮下注射各劑量的Suc和等體積的NS，4 h后，存活的大鼠處死，采集各大鼠血液備用；然后進行大鼠尸體解剖，取出心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸及肌肉等臟器組織，置-80 ℃保存。

另取一批大鼠，分別皮下注射NS和0.75 mg·kg-1Suc，4 h后，取腎臟在室溫下放置不同時間后，進行腎組織中Suc穩定性的檢測。

1.2.2Suc的大鼠急性毒性實驗 取大鼠60只，背部脫毛后，隨機分為6組，每組10只，各組大鼠分別按劑量1.84、1.66、1.50、1.35、1.21、0 mg·kg-1皮下注射Suc，觀察并記錄給藥后2 h內大鼠死亡數(腹式呼吸消失)，按照改良寇氏法進行計算。

1.2.3樣品處理

1.2.3.1血樣品處理 將上述取得的血樣品立即4 000 r·min-1離心10 min，制成血清后置-80 ℃保存。實驗時，取血清0.2 mL，加入2倍體積的乙腈，渦旋震蕩2 min，12 000 r·min-1離心15 min，取上清，過0.22 μm有機濾膜，待UHPLC-MS/MS法測試分析。

1.2.3.2組織樣品處理 分別取上述1.2.1制備的各組織樣品0.1 g，用濾紙吸去殘留血液并用超純水沖洗3次，再用濾紙吸去殘留水分，加1 mL超純水用勻漿器進行研磨90 s后加入2倍體積的乙腈使其完全沉淀，渦旋震蕩2 min，超聲10 min，12 000 r·min-1離心15 min，取上清0.5 mL過活化后的固相萃取WCX柱，在WCX柱中依次加入5%氨水溶液3 mL和100%甲醇清洗液3 mL清洗，再加入含2%甲酸的甲醇溶液3 mL進行洗脫，收集流下的液體，氮氣吹干，加入0.3 mL的水-乙腈溶液(150 ∶150，V∶V)溶解，渦旋，過0.22 μm有機濾膜，待UHPLC-MS/MS法測試分析。

1.2.4色譜條件及優化 Suc不溶于乙醚，易溶于水，水溶液呈酸性，文獻報道[12]采用Acquity UPLCTMBEH HILIC色譜柱，雖可分離藥物，但出峰時間較慢，本實驗室既往研究發現選用Phenomene Luna NH2柱，靈敏度高，出峰時間快，可快速檢測出藥物。因此，本研究采用了Luna NH2 柱(2 mm×100 mm, 3 μm，Phenomenex公司)作為色譜柱；同時考察了流動相和流速的影響，由于鹽類物質容易導致色譜柱堵塞，易污染，所以選擇0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動相；流動相的流速為0.2 mL·min-1時，出峰時間短，并且色譜峰響應值與流速為0.1 mL·min-1時無明顯差異，所以流速采用0.2 mL·min-1。柱溫是37 ℃，進樣時間為5min。在該條件下出峰時間快，峰型好，響應值和分離度高。

1.2.5質譜分析條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描下多反應監測(MRM)，噴霧電壓是5 500 V，霧化氣溫度為500 ℃，氣簾氣體壓力為35 psi。由于氯化琥珀膽堿為雙電荷離子[M]2+，所以一級母離子是145.1，兩個離子對m/z:145.1→115.4，m/z:145.1→93.3，碰撞能分別為16 V和19 V，去簇電壓均為54 V，其中m/z:145.1→115.4的響應值高，作為定量離子對。

血及各組織樣品經上述優化的超高效液相色譜分離后的質譜法測定數據由Analyst1.6.3數據處理軟件系統(AB公司)處理，并通過標準曲線來計算Suc含量。

1.2.6方法學驗證 依據FDA關于分析方法驗證指導原則進行方法學驗證，分別對方法的選擇性、線性范圍與檢測限、精密度與準確度、回收率、基質效應以及穩定性等方面進行考察。

1.2.6.1方法的選擇性 分別取空白血清0.2 mL、空白血清加標準品0.2 mL，按照步驟1.2.3項方法操作，得色譜圖，見Fig 1。結果表明，大鼠內源性物質對Suc的測定不產生干擾。

1.2.6.2線性范圍和檢測限 分別配制系列濃度血清標準樣品，按照1.2.3項方法操作處理，上機分析，以血清中Suc濃度為橫坐標，Suc峰面積為縱坐標做線性回歸，得到血清中Suc回歸方程為y=1.483 01e5x+16 493.54(r=0. 997 4)，線性范圍是0.03～1 000 μg·L-1，以S/N≥10確定本方法的最低定量下限是0.03 μg·L-1，以S/N≥3確定本方法的最小檢測限為0. 01 μg·L-1。

1.2.6.3精密度與準確度 分別用大鼠血清配制低、中、高3個濃度(0.5、20、80 μg·L-1)的樣品，每個濃度進行6個樣本分析，連續測定5 d，根據當日隨行標曲，分別計算樣品濃度，以其標示濃度為參照，按方差分析方法計算測定方法的準確度和日內、日間精密度，見Tab 1。結果表明，該方法具有良好的準確度和精密度，日內、日間精密度均小于15%，準確度為-8.0～9.7。

1.2.6.4回收率 取空白血清0.2 mL，添加不同量的Suc標準工作溶液，配制成低、中、高 3個濃度(0.5、20、80 μg·L-1)的樣品，每一濃度平行6個樣品，按照線性方程計算回收率，見Tab 1。結果表明，本方法具有良好的回收率。

Fig 1 Selectivity of method (UHPLC-MS/MS method)A～B: The chromatogram of blank serum. In the map, red curve and blue curve indicate qualitative and quantitative measurements, respectively; C～D: The chromatogram of blank serum spiked with Suc at 20 μg·L-1.

Tab 1 Results of recoveries, matrix effects, precision and accuracy for Suc in rat n=6)

1.2.6.5基質效應 取空白血清0. 2 mL，配制成低、中、高 3 個濃度( 0.5、20、80 μg·L-1)的樣品,每一濃度平行 6 個樣品，得到Suc的峰面積A1，測得3個濃度樣品的峰面積為A2。基質效應M=A1/A2×100%，計算結果見Tab 1。結果表明，該方法不存在明顯的基質效應。

1.2.6.6穩定性 取空白血清0. 2 mL，配制成低、中、高3個濃度( 0.5、20、80 μg·L-1)的樣品，每一濃度平行3個樣品，分別考察上述樣本在4 ℃保存24 h、反復凍融3次，以及-80 ℃冷凍保存兩個月的穩定性，見Tab 2，結果顯示，該樣品具有良好的穩定性。

Tab 2 Results for stability of Suc in different

2 結果

2.1 Suc致大鼠中毒情況在皮下注射4 h內，NS對照組和Suc 0.75 mg·kg-1組的6只大鼠均未出現死亡，1.5和3.0 mg·kg-1組的6只大鼠中分別有3只和6只死亡。Suc的大鼠急性毒性實驗結果顯示，Suc的LD50為1.59 mg·kg-1。

2.2 中毒大鼠血清中Suc濃度結果如Fig 2A和2B所示，NS對照組大鼠血清中未出現Suc的定性及定量色譜峰，表明在該組大鼠血清中未檢測到Suc；但Suc給藥各劑量組大鼠血清中均出現了Suc的定性和定量色譜峰，并且在0.75 ～ 3.0 mg·kg-1范圍內，增大給藥劑量，大鼠血清中Suc濃度顯著增高。

2.3 中毒大鼠臟器中Suc的分布情況NS對照組大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸及肌肉等臟器組織中均沒有檢測到Suc。Fig 3表明在0.75 mg·kg-1組大鼠除心、脾及腸組織外的上述臟器組織中檢測到了Suc；在1.5和3.0 mg·kg-1兩組大鼠的上述各臟器組織中都檢測到了Suc。這與血清中的檢測結果相似，在0.75～3.0 mg·kg-1范圍內，隨著給藥中毒劑量的增大，大鼠各器官組織中Suc含量明顯地增高，呈數倍甚至數十倍的增加。在0.75、1.5和3.0 mg·kg-13個劑量組的大鼠各臟器組織中，腎臟中Suc含量均為最高，與其它組織比較，有明顯的差異。

2.4 腎組織中Suc檢測的穩定性大鼠皮下注射NS和Suc 0.75 mg·kg-14 h后，取腎臟，室溫下放置一定時間，檢測Suc。結果如Fig 4所示，腎組織在室溫下放置12、24、36、48和72 h時，均可檢測到Suc(P<0.05或P<0.01)，但放置12 h時，Suc含量有明顯下降(P<0.01)，24 h時進一步下降，大約減少了2/3，至72 h時雖仍可測出Suc(P<0.05)，但含量很低。該結果提示在室溫下放置，腎組織中Suc發生了明顯的降解。

Fig 2 Serum Suc concentration in rats subjected to A: Original maps of chromatogram of Suc.a：NS，b～d：Suc 0.75, 1.5 and 3.0 mg·kg-1; B: Serum Suc concentration.*P<0.05,**P<0.01 vs NS.

Fig 3 Drug contents in different organs from rats subjected to n=6)The content of Suc in heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, stomach, intestine and muscle from Suc-administered rats by UHPLC-MS/MS method.**P<0.01 vs Suc contents in other organs.

3 討論

本研究首次采用UHPLC-MS/MS方法，研究了中毒量Suc皮下給藥在大鼠體內的分布情況，結果表明，UHPLC-MS/MS方法可測定中毒大鼠體內Suc的藥量，Suc在大鼠血清及心、肝、腎等組織中均有分布，其中腎臟中含量最高。這可能與其水溶性較好，易于從腎臟排泄有關[13]；Suc在肝臟中含量比心臟、肺臟等臟器低，這可能是由于肝臟的血液循環較豐沛，Suc會被血液中的假性膽堿酯酶迅速水解，并且肝臟本身也存在假性膽堿酯酶水解Suc，只有10%～15%的藥量到達作用部位肌肉，所以肌肉組織中Suc含量也較少，而腦組織中Suc的含量較肝臟低，這可能與Suc存在血腦屏障有關[14]。這為Suc中毒的法醫鑒定取材部位提供了一定的參考。

Fig 4 Stability of Suc in renal tissues at The Suc content in kidney tissues of rats containing Suc after different time at room temperature.*P<0.05,**P<0.01 vs NS group,##P<0.01 vs Suc content at 4 h.

為模擬Suc飛鏢射殺致人死亡案件，本研究采用了皮下注射的方式。研究得出大鼠Suc的LD50為1.59 mg·kg-1，采用了低、中、高(0.75、1.5、3 mg·kg-1)3個濃度進行實驗，Suc 3.0mg·kg-1組大鼠全部死亡，1.5 mg·kg-1組大鼠死亡一半，0.75 mg·kg-1組大鼠均無死亡。本研究不僅在1.5和3.0 mg·kg-1組的死亡和存活大鼠血清、心、脾、肝、肺、腎、腦、胃、腸及肌肉組織等主要臟器中均檢測到了Suc，在較低劑量的0.75 mg·kg-1組大鼠血清及除心、脾和腸以外的其它上述組織中也檢測到了Suc。結果表明UHPLC-MS/MS法不僅可檢測中毒死亡的大鼠體內Suc，也可檢測中毒較輕的大鼠血清及腎等組織中的Suc，這為今后Suc中毒的司法檢驗提供了一個有效、可靠的方法。本研究觀察到腎組織樣品中Suc在室溫下穩定性不是很好，放置12 h，Suc含量開始有明顯的下降，24 h時進一步下降，大約減少了2/3，這可能與腎組織樣品中尚殘存能分解Suc的酶或物質有關。因此，對疑似Suc中毒的法醫學取材后要盡可能地在12 h內測定或低溫保存樣本。

此外，無論在大鼠血清中，還是在上述各主要臟器中，在0.75 ～ 3.0 mg·kg-1范圍內，隨著給藥中毒劑量的增大，高劑量組大鼠體內Suc含量呈數倍甚至數十倍的增加，這可能是由于高劑量的中毒給藥量明顯超過大鼠體內代謝分解Suc的最大能力，導致未被代謝的Suc在體內大量集聚所致。本研究重點觀察了中毒劑量的Suc在大鼠體內的分布情況，至于其藥物代謝動力學其它有關參數有待今后的進一步研究。

綜上所述，本研究首次采用UHPLC-MS/MS方法發現中毒量Suc皮下給藥在大鼠血清及心、肝、腎等主要組織中均有分布，其中腎臟中含量最高；同時也為Suc中毒者體內藥量的檢測提供了一個有效、可靠的方法。

(致謝：本實驗在安徽醫科大學科研實驗中心實驗室完成，對本實驗做出貢獻的所有人員表示衷心的感謝！)