利用SMART技術構建蒙古柳cDNA-pYES2大腸桿菌文庫研究

王馨琪，劉 卉，金光德，南桂仙

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

1 研究背景

蒙古柳[Salixlinearistipularis(syn.Salixmongolica)]又名筐柳，主要分布在中國內蒙古、黑龍江、吉林等地[1]，屬于落葉小喬木植物。蒙古柳有很強的抗旱耐鹽堿性能，根系發達，有很好的防風固沙的作用[2,3]。研究表明，蒙古柳能生長在pH值9.2以上的鹽堿地，是鹽堿地土壤改良中起重要作用的野生植物資源[4]。蒙古柳的生長特性決定了體內具有適應逆境的機制，但是對蒙古柳的研究主要集中在形態結構[5]、造林[6]、環境改良[7,8]、栽培[9]、防風固沙[10]和有性繁殖等方面[11]，其基因信息和抗鹽性機理方面研究幾乎沒有報道。本研究對于非模式木本植物蒙古柳的抗逆性分子生物學的研究奠定了實驗基礎。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

植物材料：從安達鹽堿地采集的蒙古柳種子。實驗常用試劑：SMART試劑盒購自Clontech公司，DNAMarker、GoTaq酶購自TaKaRa公司，所用試劑均為國產分析純試劑。

2.2 實驗方法

蒙古柳種子的無菌消毒和培養條件：蒙古柳種子用常規方法進行表面消毒，種子播在1/2MS固體培養基中培養，培養室溫度控制在24℃±1℃，光照時間設置為9 h光照/15 h黑暗，幼苗長出3～4片真葉后取全株。

RNA的提取和質量檢測：利用改良CTAB法提取蒙古柳幼苗總RNA[12]。用DNaseⅠ消化DNA。氯仿抽提一次。用無水乙醇和醋酸鈉(3 mol/L)溶液進行沉淀，用75%酒精洗沉淀，晾干后加20 μL DEPC水溶解。測定RNA濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

蒙古柳cDNA-pYES2大腸桿菌文庫的構建：以1 μg RNA 為模板，按照SMART技術構建cDNA文庫的操作方法合成SMART第一鏈cDNA，然后以其為模板利用聚合酶鏈反應進行長鏈PCR擴增，經過15、18、21、24和27個循環后電泳檢測，找出合成雙鏈cDNA最優循環次數，用SMART樹脂柱對雙鏈cDNA 分級純化。將純化后的雙鏈cDNA通過In-Fusion 反應連接到質粒載體PYES2上，將連接產物電轉化大腸桿菌感受態細胞JM109。

文庫質量檢測：第一，測定文庫的滴度。取10 μL cDNA文庫添加到預熱過的1 mL LB培養基中，再從中取10 μL添加到1 mL LB培養基中，這樣文庫就稀釋104。從中取50 μL，涂在LB培養基，第二天計每個平板的菌落數目。計算文庫滴度(cfu·mL-1)=(菌落數×稀釋倍數)/ 受體菌的體積。第二，重組質粒的PCR鑒定。挑取轉化平板上的菌落，通過載體序列設計引物進行PCR 擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測。上游引物序列：CCGGATCGGACTACTAGCAGCTG；下游引物序列：TAGGGACCTAGACTTCAGGTTGTC。

3 實驗結果

3.1 蒙古柳RNA的提取

得到蒙古柳總RNA的OD260/OD280測定值為1.98，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，在紫外燈照射下能夠清楚地看到28 s rRNA和18 s rRNA，而且28 s rRNA的亮度大概為18 s rRNA的2倍，兩條帶之間無彌散現象，說明RNA完整沒有降解，提取的RNA質量較好，可以用于cDNA文庫構建，如圖1。

圖1 蒙古柳幼苗總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis mapping of total RNA in Salix linearistipularis seedlings

3.2 蒙古柳cDNA-pYES2大腸桿菌文庫的構建

以1μg RNA為模板，合成SMART第一鏈cDNA，以該cDNA第一鏈作為模板通過長距離PCR擴增，進行15、18、21、24、27個循環，得到雙鏈cDNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2。

圖2 M：LD5000DNA Marker；1.2.3.4.5：通過15、18、21、24、27個 循環次數擴增的雙鏈cDNA的PCR產物電泳檢測Fig.2 M：LD5000DNA Marker；1.2.3.4.5： PCR product electrophoresis of double-stranded cDNA amplified by 15, 18, 21, 24, 27 cycles

選擇21個循環次數為雙鏈cDNA的PCR最優循環次數。合成的雙鏈cDNA片段長度大部分在0.5～2.0 kb范圍內，表明合成的cDNA質量較好。用試劑盒中SMART樹脂柱對雙鏈cDNA 進行分級分離，分離產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小如圖3，將4～8號管中收集的cDNA分離產物用醋酸鈉沉淀后純化cDNA。

圖3 雙鏈cDNA分級分離Fig.3 Double-stranded cDNA hierarchical isolation

3.3 cDNA質量鑒定

將蒙古柳cDNA文庫連pSMART載體電轉化到大腸桿菌感受態細胞，每個平板長出2 000多個單克隆。根據文庫滴度測定方法，每個培養基長出30個單克隆，測定培養基中原始文庫滴度為6×106cfu·mL-1。從培養基上長出的大腸桿菌中任意挑選16個單克隆進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示如圖4。

圖4 cDNA文庫插入片段的PCR檢測Fig.4 PCR detection of cDNA library insertion fragments

從圖4看出，大腸桿菌中插入的片段大部分在0.5～2.0 kb，平均長度為0.8 kb，重組率接近100%，基本上每個菌中都轉入了蒙古柳基因，得到了蒙古柳cDNA-pYES2大腸桿菌文庫。

4 討論

利用SMART技術構建cDNA文庫是產生高質量cDNA可靠的方法。SMARTcDNA合成技術是基于PCR的方法構建cDNA文庫，它被設計為優先富集全長cDNAs。采用LD-PCR 技術擴增雙鏈cDNA 的第二條鏈，僅具有SMART錨定序列的5′端的那些SS的cDNA可以作為模板被成倍擴大，不完整的cDNA和基因的聚A-RNA的轉錄會缺乏SMART錨，不會被擴大，因此污染的基因組DNA和聚A-RNA被消除。這種選擇性擴大，可以構建cDNA文庫具有高比例全長克隆。利用SMART樹脂柱對cDNA 進行分級分離，可有效除去小片段的cDNA。

文庫滴度、重組率和插入片段的大小是鑒定cDNA文庫質量的標準。本實驗中這些數據說明得到的cDNA能滿足構建文庫要求。蒙古柳cDNA文庫的構建為耐鹽基因的挖掘和揭示耐鹽分子機制奠定了基礎。