基于轉錄和翻譯調控的氨基酸高產菌株篩選及構建策略

鄭博 王寧 霍毅欣

（北京理工大學生命學院，北京 100081）

自20 世紀60 年代首次實現發酵法生產谷氨酸以來，微生物發酵技術憑借其成本低廉、工藝簡單和易于分離等特點，迅速擴大生產規模，增加多種氨基酸生產工藝，將氨基酸產品產值升至逾百億美金，涉及飼料添加劑、保健品和化妝品等多種行業［1］。目前，除蛋氨酸等個別氨基酸仍依賴于化學合成及酶催化以外，其余均可采用微生物發酵技術生產，不少廠商已開始通過轉向合成氨基酸衍生物等高附加值產品以緩解趨于飽和的氨基酸市場［2］。

高產穩定的微生物菌株無疑是支撐大規模發酵生產氨基酸的基本保障。然而，野生菌株通過精細的代謝調控機制以避免產生過多的氨基酸。最初研究人員通過篩選營養缺陷型菌株，成功獲得了可以積累鳥氨酸和賴氨酸的多種缺陷型菌株［3-4］。然而，營養缺陷型菌株并沒有真正意義上解除反饋機制，其應用范圍也止步于此。1950 年有研究發現具有氨基酸類似物抗性的菌株同時具有向胞外分泌氨基酸的特性［5-6］，并于1970 年首次利用氨基酸類似物篩選出高產賴氨酸的菌株［7］。該方法的本質是對胞內翻譯過程的競爭性抑制（圖1）。這些類似物的結構、分子量和電荷特性與組成蛋白質的氨基酸十分相近，可以與對應的氨基酸競爭數量有限的tRNA，卻無法參與肽鏈的延伸［8］。它們所結合的tRNA 比例越高，對蛋白質正常翻譯的阻礙就越大，最終導致菌體生長減緩甚至死亡［9-10］。

圖1 氨基酸類似物篩選氨基酸高產菌株作用機理

因此，通過簡單正篩實驗，從突變菌中挑取能夠在高濃度氨基酸類似物條件下生長最快的菌落，即有可能獲得高產氨基酸的突變菌株。氨基酸類似物的篩選工作幾乎覆蓋了20 種天然氨基酸（表1），也涉及不同種屬的菌株，極大地推進了微生物大規模生產氨基酸的工業化進程。然而，高濃度的氨基酸類似物會干擾細胞代謝甚至影響細胞結構［11-12］，部分突變會賦予細胞隔離、外排甚至降解氨基酸類似物的能力［10，13］，從而擺脫篩選壓力。

目前，使用氨基酸類似物篩選氨基酸高產菌株的方法已經貢獻出許多優良的生產菌株，但是對菌株產量提升的幅度越來越小。一方面是因為長期使用的類似物種類有限，導致從篩選菌株中獲得新突變的難度變大；另一方面是由于早期的生產菌株多是通過對隨機突變庫進行多輪篩選得到，在提高氨基酸發酵產量的同時在菌株基因組中引入了不確定的突變，可能導致進一步提高氨基酸積累的困難。近年來，氨基酸生物傳感器相關研究不斷產生突破。利用富含稀有密碼子的基因篩選氨基酸高產菌株的策略也被提出，提供了面向更加廣譜的微生物菌種的高效、準確和簡便的篩選方法，利用該方法篩選獲得的菌株可以為微生物生產和積累氨基酸的研究提供更豐富的基因信息。

1 利用稀有密碼子篩選氨基酸高產菌株

在肽鏈合成過程中，密碼子可被對應的氨酰tRNA 識別并翻譯成氨基酸。然而，不同密碼子對應的tRNA 的相對豐度并不相同，翻譯高頻密碼子的tRNA 在胞內的含量最為豐富，而翻譯稀有密碼子的tRNA 含量較低［26］。在同類tRNA 競爭游離氨基酸的過程中，含量豐富的tRNA 有更大的概率競爭到氨基酸并完成高頻密碼子的翻譯。因此，將異源蛋白編碼基因中的密碼子替換為宿主偏好的高頻密碼子可以顯著提高目標蛋白質的表達量，由此催生了“密碼子優化”策略［27］。在氨基酸饑餓的情況下，稀有tRNA 在與其他tRNA 的競爭中難以捕獲到足夠的氨基酸，常處于“空載”狀態，難以完成稀有密碼子的翻譯。因此在氨基酸饑餓條件下，富含稀有密碼子的異源蛋白編碼基因的翻譯速率普遍緩慢，甚至無法進行。只有當胞內氨基酸濃度大幅提升并使大部分tRNA 維持“滿載”時，稀有tRNA 才有機會捕獲到剩余的氨基酸［28］，富含稀有密碼子的基因才能正常表達。這些能夠在胞內累積氨基酸的菌株即是所謂的氨基酸高產菌株（圖2）［29］。

表1 氨基酸類似物及其篩選結果

圖2 氨基酸饑餓條件下稀有密碼子數量與翻譯速率的關系

與氨基酸類似物競爭性地抑制翻譯過程相似，利用富含稀有密碼子的篩選標記可以將翻譯過程與胞內氨基酸濃度建立關聯，并在氨基酸饑餓的條件將差異進一步的放大，最終通過生長和表型差異篩選氨基酸高產菌株。根據所用篩選標記的不同，該方法可以分為選擇系統和篩選系統。前者使用抗生素抗性基因，表現為菌體的生長水平差異，后者使用顏色蛋白、熒光等表型基因，表現為菌體特征差異。在兩種篩選系統中，質粒拷貝數和標記基因的啟動子強度會影響菌體的生長。改變稀有密碼子的頻率，以及更換復制起始位點或啟動子可調節系統的選擇強度。實驗表明使用弱啟動子和拷貝數較低的復制起始位點更有助于提高系統的選擇或篩選能力。當使用誘導型啟動子時，可設定不同的誘導劑量逐級改變啟動子強度，從而確定最佳的誘導水平。

突變不僅能夠賦予菌株高產某種氨基酸的特性，還有可能造成對抗生素的抗性，導致以抗生素抗性基因為篩選標記的選擇系統中出現假陽性的結果。以上假陽性現象可通過兩種途徑消除：其一是向選擇系統質粒中插入gfp等顏色指示基因，存活于抗生素脅迫的菌株可通過熒光或顏色表型進行復篩，以確保選擇系統功效的發揮；還可構建含有兩種抗生素抗性基因的選擇系統以消除假陽性菌株。除富含稀有密碼子的抗性基因外，該質粒系統上還插入了針對另外一種抗生素的野生型抗性基因。在誘變中獲得了一種抗生素抗性的菌株幾乎不可能同時獲得針對另一種抗生素的抗性。因此，任何存活于兩種抗生素脅迫條件下的菌株都應含有篩選質粒并具備更強的氨基酸合成能力。除常見的抗性基因外，sacB［30］、tolC［31］和ccdAB［32］等毒素-解毒系統也可用于選擇及篩選系統的構建。當采用這類基因時，可將解毒基因上的密碼子替換為其稀有形式。此時，只有能夠高產對應氨基酸的菌株才可以維持解毒基因的表達，從而產生足夠量的解毒蛋白使菌株得以生存。

以上高、低豐度tRNA 對胞內游離氨基酸的競爭機制為氨基酸生物傳感器的設計提供了新思路。將基因中的密碼子替換為其稀有形式即可提高翻譯過程對氨基酸含量要求的“門檻值”，此時，蛋白的表達速率可反映胞內氨基酸的濃度。通過將蛋白質的表達水平與菌體生長或顏色表型相偶聯，即可從菌株庫中快速鑒別出可能的氨基酸高產菌株。該策略對細胞結構及胞內其他生化過程無負面影響，理論上可以克服氨基酸類似物篩選法的缺陷。

2 稀有密碼子篩選策略的應用拓展

密碼子偏好性的發現及其延伸出的稀有密碼子的概念和密碼子優化的技術方案，該方案解決了基因工程中異源蛋白表達困難的問題［27］。但是不斷有研究發現，稀有密碼子的作用不僅僅是限制mRNA的翻譯速率，它們在穩定mRNA 二級結構、調控肽鏈延伸速率和輔助蛋白折疊等方面也有非常重要的作用。替換某些必需基因中的稀有密碼子（如精氨酸稀有密碼子AGR）可能會影響序列結構和翻譯起始，從而造成細胞死亡［33-35］。利用稀有密碼子造成的翻譯脅迫篩選氨基酸高產菌株方法，本質上是在饑餓條件下多種tRNA 競爭氨基酸的過程，證明了增加稀有密碼子數量這一“密碼子負優化”方式可以顯著減緩甚至終止mRNA 的翻譯。在某些基因（如dCas9）中增加稀有密碼子的數量，限制其在生長前期的表達量，在需要的時候通過補加氨基酸來調控特定基因的翻譯。這種類似誘導表達的模式具有調節精確，無泄露表達，不影響細胞正常生長等特點，且價格遠低于常用誘導劑。

部分氨基酸的密碼子數量較少，細胞對這部分同義密碼子的使用頻率沒有明顯的差異，限制了該方法在此類氨基酸高產菌株篩選中的應用。通過引入異源的tRNA 和氨酰tRNA 合成酶（Aminoacyl tRNA Synthetase，aaRS）正交對能夠針對性的解決以上問題。通常經過篩選得到的tRNA 和aaRS 正交對相互識別，且獨立于宿主翻譯系統中的其它正交對，可以成功將非天然氨基酸插入到肽鏈中，實現蛋白質功能的改造［36］。目前使用非天然氨基酸改造蛋白質的研究已經較為成熟。利用終止密碼子等三聯體密碼子將非天然氨基酸插入肽鏈的策略可能干擾基因組其它基因的正常翻譯。一方面有研究通過人工修改基因組序列，構建僅有63 種甚至61 種密碼子的大腸桿菌［37-38］；另一方面使用翻譯四聯體密碼子的tRNA 和aaRS 正交對，既能夠解決菌株中沒有稀有密碼子的問題，又可以避免干擾胞內正常tRNA 的工作［39］。因此，通過改造tRNA 反密碼子環或者引入翻譯四聯體密碼子的tRNA 及其aaRS正交對，可以人為地在胞內引入“稀有”密碼子及tRNA，從而實現對其余氨基酸高產菌株的篩選。這一策略不僅可以為常用的生產菌株篩選出更多新的突變位點，更重要的是可以憑借密碼子的普適性，將篩選范圍拓展至具有多密碼子的氨基酸及所有微生物物種，為氨基酸高產菌株的篩選提供了高效解決方案。

3 基于轉錄與翻譯調控胞內氨基酸合成

微生物細胞通過不同層級的轉錄調控來實現基因功能的選擇性發揮，進而將資源引導至不同的生命活動形式，而翻譯是轉錄的終點，是實施調控的關鍵環節，它允許細胞在mRNA 合成終止后對蛋白質合成進行再次干預，這對于延長發酵時間、增加底物利用率和目標代謝物產量有重要意義。目前通過轉錄和翻譯調控的強化，以分配合理化、功能多樣化及途徑最優化等理念，成功構建了用于生產生物燃料、糖醇和芳香族化合物等物質的高產菌株［40］。基于轉錄和翻譯水平的工程改造可針對翻譯速率與翻譯的持續性兩部分展開，直接影響了途徑酶的生成速率與總量［41-42］。

3.1 翻譯速率

許多目標合成途徑包含異源基因，因缺少與之匹配的原生翻譯系統，異源基因在底盤宿主內的表達常受到阻礙。即便對于宿主來源的基因，其表達產生蛋白的效率也往往難以達到規模化生產的要求。翻譯速率的優化可以使細胞在單位時間內產生更多的酶，從而由生長狀態快速投入至生產活動，也能使細胞工廠及時補充生產過程中酶的消耗，確保生產的持續進行［43-44］。

翻譯速率的優化可以從翻譯的起始和肽鏈的延伸兩個過程入手。前者依賴于對核糖體結合區域（RBS）（原核）或mRNA 的5'端帽（真核）的改造，旨在加強mRNA 招募核糖體的能力，提升核糖體起始翻譯的效率［9］。優化后的RBS 可以使蛋白表達量提升數倍，進一步驅動目標化合物的生成［10］。調控肽鏈延伸的常用手段是密碼子優化，它依據宿主的密碼子偏好性，將異源基因中的稀有密碼子替換為宿主常用的密碼子形式，使其更容易被宿主的tRNA讀取，從而將核酸信息快速翻譯為氨基酸序列。與原始基因相比，優化后的基因在微生物宿主中的表達效率可提高100 倍以上［45］。此外，mRNA 中的二級結構也會阻礙核糖體的移動并降低翻譯速率［46］，這一負面作用也可通過密碼子優化消除［47］。

3.2 翻譯的持續性

作為翻譯的模板，mRNA 的穩定性將直接影響翻譯過程的持續時間。穩定的mRNA 可供翻譯系統反復使用，使細胞以最少的轉錄投入獲得預期的蛋白產量。該策略彌補了基因表達過程中轉錄環節的限制，可有效提升低拷貝途徑基因的表達水平［11］。一般可通過向mRNA 的5'或3'端引入發卡或莖環結構，保護片段不被RNA 酶降解［12-13］。

對轉錄和翻譯水平的正向調控可以使微生物工廠合成目標代謝物的能力得到提升，而對翻譯水平的負調控則為篩選氨基酸高產菌株提供了全新的思路［29，48］。參與蛋白質合成的20 種氨基酸總共由61個密碼子編碼，除蛋氨酸和色氨酸外，每一種氨基酸至少對應兩種以上的密碼子，其中精氨酸、亮氨酸和絲氨酸的同義密碼子數量可達6 個［49］。原核與真核生物均表現出對特定密碼子的使用偏好性，其中使用頻率較低的一類密碼子被稱為稀有密碼 子［50-51］。密碼子使用的偏好性因物種而異，一種生物的高頻密碼子可能是另一種生物的稀有密碼子［52］。這一偏好性會影響異源基因的翻譯起始［53］、肽鏈延伸［54］及蛋白折疊［55］等過程。

4 總結與展望

目前仍有一些氨基酸缺少能夠用于大規模生產的菌株。一方面由于傳統篩選方法的局限性，某些途徑特殊的氨基酸必須經過多種類似物的輪流篩選，但產量難有顯著提升；另一方面是對高產菌株進行進一步基因編輯或整合多種優勢突變時難度較大，缺乏對微生物細胞工廠理性設計及優化的技術基礎。已經有研究僅對谷氨酸棒狀桿菌基因組進行12 處編輯，其賴氨酸的產量提高至120 g/L［56］。因此，需要將全新的篩選方法應用于多種氨基酸、不同菌種的篩選中，獲得更多的優勢突變信息，為分析和構建氨基酸高產菌株提供更多的基因信息；同時也利用簡易高效的基因編輯技術，整合多種優勢突變信息于單一菌株中，從頭構建可用于大規模生產的工業菌株，在轉錄和翻譯水平針對性設計優化胞內代謝流分配，最終將菌株的生產能力和效率提升到新的水平。