一例孔雀大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗分析

李佳璇 王洪利 亓愛杰 孫圣福 藺曉月 邢林林 王苗利 陳靜

摘? 要：2018年12月份，濱州市某孔雀養殖場的部分孔雀出現了咳嗽、腫臉、糞便發綠發黑等情況，場主給發病孔雀用了多種抗生素，療效均不明顯，且該場孔雀自首例發病已兩個月，累計死亡20多只，還有100只正在發病，基本都是小孔雀。實驗室接到病例后立即采樣，進行病毒PCR檢測、細菌分離純化培養、生化鑒定和藥敏試驗，結果顯示禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎均為陰性，僅分離到大腸桿菌，藥敏試驗結果顯示該大腸桿菌敏感的藥物為頭孢類藥物，根據此結果指導該場臨床科學用藥，取得了良好的治療效果。

關鍵詞：孔雀;大腸桿菌;細菌分離鑒定;藥敏分析;耐藥性;臨床用藥

中圖分類號：S858.39???? 文獻標識碼：C???? 文章編號：1673-1085（2020）3-0043-04

大腸桿菌（Escherichia coli），又稱大腸埃希菌，為兩端鈍圓的短桿菌，是革蘭氏陰性菌，無芽孢，大多數大腸桿菌菌株有莢膜或微莢膜結構，多數有菌毛[1]。大腸桿菌正常寄居于動物腸道中，但其中小部分可在一定條件下致病，如在動物體免疫力下降時，主要是由特定的菌毛抗原等感染引起人或動物胃腸道疾病，此外，還可引起尿道感染、關節炎等[2]。

當禽類機體防御能力下降時，常引起繼發性局部或全身感染。禽致病性大腸桿菌是危害養禽業的重要病原。該病原能夠引起禽類多種腸道和體外疾病，還能夠引起雞與鴨的敗血癥、氣囊炎和腹膜炎，以及鵝的生殖器官感染等，造成肉禽質量降低，蛋禽產蛋下降，給養禽業帶來嚴重的損失[3]。

1? 臨床調查情況

2018年12月份，濱州市某孔雀養殖場部分孔雀出現了咳嗽、腫臉、糞便發綠發黑的情況，畜主給病禽使用過泰樂菌素、泰妙菌素、氟苯尼考、替米考星等抗生素，效果均不明顯。該孔雀養殖場已發病2個月，死亡了20多只，還有100只孔雀正在發病，但是種孔雀基本正常，發病死亡的均為小孔雀。經過進一步了解，該場孔雀平均年產蛋為30枚/只，孵化需28d，孵化率為70%，孔雀每天吃100g飼料。實驗室接到孔雀場主送來的死孔雀樣本后，立即采樣，用肝臟和肺臟作為樣本進行實驗室檢測。

2? 試驗材料與方法

2.1? 主要材料

2.1.1? 主要儀器設備? 羅氏熒光定量PCR儀，科馬嘉顯色培養基，奧林巴斯顯微鏡，移液器（0～300μl），梅里埃生化及藥敏儀VITECⅡcompact60，生物安全柜。

2.1.2? 試劑盒? 禽傳染性支氣管炎病毒（AIBV）核酸檢測試劑盒（熒光-PCR法），購自廣州維伯鑫生物科技有限公司;禽流感病毒病原熒光PCR檢測試劑盒，購自北京森康生物技術開發有限公司;雞新城疫病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒，購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。

2.1.3? 主要試劑? 梅里埃生化鑒定卡片，梅里埃藥敏鑒定卡片，營養瓊脂，革蘭氏染色液，酒精，碘酊，0.45%氯化鈉溶液。

2.2? 試驗方法

2.2.1? 病毒檢測? 將病料剪下一小塊，研磨，加入PBS緩沖液，放于離心管內，在離心機內轉速8000r/s離心2min。在生物安全柜內操作，取上清液加入到深孔板中，用羅氏自動核酸提取儀提取核酸。根據試劑盒使用說明配置反應液，將核酸與反應液混合，放入羅氏熒光定量PCR儀，根據試劑盒說明書設定PCR循環參數，1h后讀取結果。

2.2.2? 病料接種與培養? 點燃酒精燈，無菌環境操作，取病變較為嚴重的肝臟作為接種病料，選取病變部位和健康部位交界處，表面用酒精棉球和碘酊棉球消毒三遍，取小剪刀，先于酒精燈上燒烙，然后在病料表面按壓，使剪刀降溫。接著在選定好的區域內剪開一個小口，用無菌棉棒伸到小口中蘸取病料，使用三劃線法，于顯色培養基上劃線接種，注意每劃一次線就要更換一次無菌棉棒。接種完成后，將培養基倒置，放于志賀氏厭氧培養箱中，37℃培養24h。

2.2.3? 細菌的染色及鏡檢? 在潔凈的載玻片上滴一滴清水，用接種環挑取顯色培養基上的菌落溶解于載玻片上的清水中，置于酒精燈上進行加熱固定，此步驟注意溫度不可過熱，固定好后進行革蘭氏染色，染色步驟為：初染用草酸銨結晶紫溶液染色1.5min，用溫和的水流沖洗;媒染用革蘭氏碘液染色1.5min，用溫和的水流沖洗;脫色用95%的乙醇溶液脫色45s，用溫和的水流沖洗;復染用復紅溶液染色20s，用溫和的水流沖洗。將載玻片自然晾干或置于酒精燈上微微加熱烤干，將松柏油滴加在染色區域內，置于100倍油鏡下觀察。

2.2.4? 細菌的分離及純化培養? 根據顯色培養結果及鏡檢結果，用接種環挑取單個菌落，在營養瓊脂平板上劃線接種，將平板倒置，放于志賀氏厭氧培養箱中，37℃培養24h。

2.2.5? 生化鑒定及藥敏分析? 觀察純化結果，營養瓊脂平板放入生物安全柜，根據革蘭氏染色結果選擇合適的生化鑒定卡片和藥敏分析卡片，準備無菌棉棒若干，配好的0.45%氯化鈉溶液一瓶，小試管兩支置于生物安全柜中。開始制備菌懸液，在卡架上放上兩支小試管，各加入無菌0.45%氯化鈉溶液3ml，用無菌棉棒挑取純化培養的單菌落于氯化鈉溶液中接種，使其濃度保持在0.56～0.83Mc，插入生化鑒定卡片。用移液器吸取接種好的菌懸液145μl，接種到新的裝有0.45%氯化鈉的小試管中，抽吸均勻，并插入藥敏分析卡片，上機，待18h后讀取結果。

3? 結果與分析

3.1? 病毒檢測結果? 根據羅氏熒光定量PCR儀給出的圖像以及ct值結果，我們可以得知，雞傳染性支氣管炎、禽流感和新城疫檢測結果均為陰性。

3.1? 病料接種及培養結果? 將顯色平板從志賀氏厭氧培養箱中取出，可以觀察到平板上有一種粉紫色菌落生長。

3.2? 細菌的染色及鏡檢結果? 通過100倍油鏡觀察革蘭氏染色結果，觀察到紅色、兩端鈍圓的短桿菌，為革蘭氏陰性桿菌。

3.3? 細菌生化鑒定及藥敏分析結果? 根據以上結果，選擇GN生化鑒定卡片和GN13藥敏分析卡片，將卡片裝備在已經接種好的菌懸液中，放入生化及藥敏儀，經過18h的生化鑒定及藥敏分析，得出生化鑒定結果及敏感藥物，其生化鑒定結果見表1，藥敏分析結果見表2。

根據表1可得出，該生化鑒定結果符合大腸桿菌生化圖譜，鑒定結果為大腸桿菌，是置信度好的鑒定結果，其符合率是91%。

根據表2中MIC血藥濃度及其解釋可得出，該孔雀養殖場的大腸桿菌的敏感藥物為厄他培南和頭孢類藥物，首選藥物是頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟，可以交替或混合使用，避免產生耐藥性。

4? 討論

病毒檢測和細菌分開鑒定結果顯示：該孔雀養殖場是單一大腸桿菌感染引起的疾病。結合藥敏試驗以及MIC血藥濃度值可以得出頭孢類藥物是治療此孔雀場大腸桿菌病的首選藥物，并且要控制血藥濃度，防止抗生素濫用。考慮到細菌可能會出現耐藥性，建議該孔雀場場主將頭孢他啶等藥物混合或交替使用。大腸桿菌可以在機體抵抗力下降時引起動物體發病[2]，還與養殖場飼養環境密切相關，因此建議該養殖場場主注意養殖場內衛生，及時清理糞便及病死孔雀的尸體，進行無害化處理，舍內、外定期消毒，注意通風，注意孔雀飼料及飲水健康，強化孔雀場的科學管理，嚴格管控場內飼養人員及外來人員流動，防止外部人員將病菌帶入場內。近年來，大腸桿菌的耐藥圖譜不斷擴大，呈現多重耐藥趨勢[4]，因此，對于大腸桿菌病

最好的防控措施為預防，科學合理地管理養殖場，改善飼養環境，從而減少大腸桿菌感染。若出現大腸桿菌感染，要及時送檢，在實驗室診斷和藥敏分析結果的指導下，科學地、合理地臨床用藥。

參考文獻：

[1]? 陸承平.獸醫微生物學[M].第5版.北京：中國農業出版社，2016：94-95.

[2]? 殷澤祿，萬虎.大腸桿菌的研究綜述[J].甘肅畜牧獸醫，2019（5）：33-35.

[3]? 王怡平，孫暢，趙麗麗，陳洪巖.鑒別禽致病性大腸桿菌與禽非致病性大腸桿菌的多重PCR檢測方法的建立及初步應用[J].中國獸醫科學，2018，48（11）：1358-1364.

[4]? 王影，李欣南.大腸桿菌耐藥性產生與傳播機制研究現狀[J].現代畜牧獸醫，2016，（1）：32-36.

基金項目：山東省家禽產業體系創新團隊：SDAIT-11-13。

通訊作者：王苗利，（1987.07-），中級獸醫師，主要從事動物疫病檢測、流行病學、環境微生物方向的工作，E-mail：wangmiaoli1987711@163.com;并列通訊作者：陳靜（1968-），研究員，山東省家禽產業體系省綜合試驗站站長，主要從事動物疫病快速診斷、疑難病癥確診、疫情監測和疫病普查、動物流行病學調查、實驗室管理、獸醫新技術培訓與推廣及實用防治技術研究等工作，E-mail：1752058646@qq.com。