基于響應面法的大黃產地加工炮制一體化工藝研究

辛二旦，司昕蕾，邊甜甜，牛江濤，張育貴，張淑娟，李越峰

論著·中藥研究與開發

基于響應面法的大黃產地加工炮制一體化工藝研究

辛二旦1，2，司昕蕾1，2，邊甜甜1，2，牛江濤1，2，張育貴1，2，張淑娟1，2，李越峰1，2

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

采用響應面法優選大黃產地加工與炮制一體化加工工藝。以大黃中蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷等11種化學成分含量的綜合評分作為考察指標，以含水量、切制規格和干燥溫度為考察因素，采用Box-Behnken響應面試驗設計優化大黃的產地加工炮制一體化工藝。大黃產地加工炮制一體化最佳工藝條件為：含水量為35%，切制規格為2.5 mm，干燥溫度為60 ℃。本研究優選的工藝簡便易行，精確度良好，可用于大黃產地加工炮制一體化。

響應面法；大黃；產地加工炮制一體化；高效液相色譜法

大黃為蓼科植物掌葉大黃L.、唐古特大黃Maxim. ex Balf.或藥用大黃Baill.的干燥根及根莖[1]。大黃始載于《神農本草經》，味苦寒，列為下品，具有“下瘀血，血閉寒熱，破癥瘕積聚，留飲宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調中化食，安和五臟”之功，廣泛用于治療大便秘結、癰腫、疔瘡、血熱妄行引起的各種出血等。現代研究表明，蒽醌類成分是大黃的重要活性成分，與大黃的藥理作用密切相關，具有瀉下、抗炎、抗腫瘤、保護心血管等藥理作用[2-6]。

2015年版《中華人民共和國藥典》規定，大黃秋末莖葉枯萎或次春發芽前采挖，除去細根，刮去外皮，切瓣或段，繩穿成串干燥或直接干燥，制成大黃藥材，大黃藥材除去雜質，洗凈，潤透，切厚片或塊，晾干，得大黃飲片[1]。可見，從大黃藥材到大黃飲片，需經過2次干燥、2次浸潤過程，這將不可避免地導致大黃水溶性成分流失，導致藥效下降。此外，甘肅等地大黃藥材干燥方法多采用柴火熏干，存在以下問題：①大黃產地熏干需2個月左右，耗時長，工藝繁瑣；②熏干需要大量柴火，破壞自然資源，污染生態環境；③大黃緩慢熏干干燥過程中容易出現糠心、發霉、變質、變色。為此，本試驗以蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-葡萄糖苷、大黃素-1-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的綜合評分為指標，運用Box-Behnken響應面試驗設計方法，將藥材產地加工和飲片炮制合二為一，優選大黃產地加工炮制一體化工藝，并探討產地加工炮制一體化大黃飲片的優勢，為大黃飲片的質量控制及臨床規范用藥提供依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司），SB-5200 DTD超聲清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），BT125D十萬分之一分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司），101-2A電熱鼓風干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

試驗所需大黃樣品采自甘肅省隴南市洮坪鄉興隆村，經甘肅中醫藥大學中藥鑒定教研室王明偉副教授鑒定為蓼科植物2年生掌葉大黃L.的新鮮根。對照品蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷（批號PS010709）、大黃酸-8-O-葡萄糖苷（批號PS011174）、大黃素-1-O-葡萄糖苷（批號PS010701）、大黃酚-8-O-葡萄糖苷（批號PS010712）、大黃素-8-O-葡萄糖苷（批號PS01119）、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷（批號PS010713），成都普思生物科技股份有限公司，純度≥98%；大黃酸（批號180208）、大黃素（批號180126）、蘆薈大黃素（批號180226）、大黃酚（批號180518）、大黃素甲醚（批號180117），北京北納創聯生物技術研究院，純度≥98%；甲醇（色譜純，批號20180502）、85%磷酸（色譜純，批號20160307），天津市大茂化學試劑廠。

2 方法與結果

2.1 指標成分含量測定

2.1.1 色譜條件

采用Agilent HC-C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.1%磷酸-甲醇，梯度洗脫（0～15 min，40%～50%甲醇；15～30 min，50%～60%甲醇；30～50 min，60%～80%甲醇；50～80 min，80%～100%甲醇），流速1.0 mL/min，檢測波長410 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

注：A.結合型蒽醌混合對照品；B.游離型蒽醌混合對照品；C.供試品；1.蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷；2.大黃酸-8-O-葡萄糖苷；3.大黃素-1-O-葡萄糖苷；4.大黃酚-8-O-葡萄糖苷；5.大黃素-8-O-葡萄糖苷；6.大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷；7.蘆薈大黃素；8.大黃酸；9.大黃素；10.大黃酚；11.大黃素甲醚

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷0.65 mg、大黃酸-8-O-葡萄糖苷1.21 mg、大黃素-1-O-葡萄糖苷0.28 mg、大黃酚-8-O-葡萄糖苷1.06 mg、大黃素-8-O-葡萄糖苷2.12 mg、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷1.02 mg，置于5 mL容量瓶中，70%甲醇定容至刻度，搖勻，配制成大黃結合型蒽醌混合對照品貯備液；精密稱取蘆薈大黃素2.33 mg、大黃酸2.12 mg、大黃素1.75 mg、大黃酚3.96 mg、大黃素甲醚1.66 mg，置于5 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，配制成大黃游離型蒽醌混合對照品貯備液[7]。

2.1.3 供試品溶液制備

精確稱取樣品粉末（過4號篩）1.0 g，置150 mL錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，30 ℃超聲（頻率40 kHz，功率200 W）40 min后，取出，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.4 線性關系考察

將上述混合對照品溶液分別梯度稀釋為5個不同濃度，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，每次10 μL，記錄各待測成分色譜峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表1。可見，各待測成分在相應進樣范圍內線性關系良好。

表1 11種蒽醌類成分線性關系考察結果

成分 回歸方程R2線性范圍/μg 蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷Y＝26 119X－0.139 90.999 50.006 5～1.30 大黃酸-8-O-葡萄糖苷Y＝7632.7X＋33.5670.999 50.012 1～2.42 大黃素-1-O-葡萄糖苷Y＝16 526X－2.911 60.999 90.014 0～0.56 大黃酚-8-O-葡萄糖苷Y＝9244.8X＋20.5750.999 60.010 6～2.12 大黃素-8-O-葡萄糖苷Y＝16 374X＋34.2150.999 80.021 2～4.24 大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷Y＝2784X＋20.5920.999 60.010 2～2.04 蘆薈大黃素Y＝21 300X＋63.8930.999 70.023 3～4.66 大黃酸Y＝6023.9X＋72.890.999 60.053 0～4.24 大黃素Y＝25 950X－5.045 90.999 50.017 5～3.50 大黃酚Y＝12 304X＋167.950.999 60.039 6～7.92 大黃素甲醚Y＝2158.5X＋32.8110.999 60.041 5～3.33

2.1.5 精密度試驗

分別精密吸取混合對照品溶液各10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件，連續進樣6次，分別記錄各成分的峰面積積分值，計算RSD為0.46%～2.33%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗

取同一大黃供試品溶液，于4 ℃放置保存，按“2.1.1”項下色譜條件，分別于0、4、8、12、20、24 h進樣檢測并記錄峰面積，計算RSD為1.32%～2.89%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.7 重復性試驗

精密稱取同一大黃樣品1.0 g，共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，并記錄各成分峰面積，計算RSD為1.09%～2.89%，表明本法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗

取同一批已測定的大黃樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置于250 mL具塞三角瓶中，分別加入相同質量的對照品，最后加入甲醇溶液25 mL，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，測定各成分的色譜峰面積，計算含量和回收率。結果顯示，11種蒽醌類成分的平均回收率為95.07%～102.35%，RSD為2.69%～3.48%，表明本方法的準確性較好。

2.1.9 樣品含量測定

精密稱取大黃樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，測得各成分峰面積積分值，代入線性回歸方程，以外標法計算樣品中各成分的含量。

2.2 產地加工炮制一體化工藝優選

2.2.1 Box-Behnken試驗設計與結果

在預試驗基礎上，以含水量（A）、切制規格（B）、干燥溫度（C）為考察因素，采用Design Expert 8.0軟件設計三因素三水平Box-Behnken試驗方案。以大黃蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷（X1）、大黃酸- 8-O-葡萄糖苷（X2）、大黃素-1-O-葡萄糖苷（X3）、大黃酚-8-O-葡萄糖苷（X4）、大黃素-8-O-葡萄糖苷（X5）、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷（X6）、蘆薈大黃素（X7）、大黃酸（X8）、大黃素（X9）、大黃酚（X10）、大黃素甲醚（X11）的綜合評分為因變量，采用加權評分法優選大黃產地加工炮制一體化工藝。以含量最大值為100分，按其他含量值占最大值的比例劃分，由于其藥效貢獻值大小未知，故設定權重系數均為1/11，計算綜合評分（Y）。Y＝（X1/max1＋X2/max2＋……X11/max11）×100/11[8-9]。試驗因素水平見表2，試驗方案與結果見表3。

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平

水平含水量/%切制規格/mm干燥溫度/℃ ABC -1302.055 0352.560 1403.065

2.2.2 模型建立與分析

將各組綜合評分數據采用Design Expert 8.0軟件進行多元回歸和二項式分析，建立綜合評分對3個因素的二次回歸模型方程：＝96.06－4.35－0.15－5.27－3.96－2.72＋2.59－15.72－6.692－7.082。對回歸模型進行方差分析，結果見表4。模型＝56.20，＜0.01，表明該模型在本試驗范圍內有統計學意義，該回歸模型與試驗數據擬合程度高，可用于優選大黃產地加工炮制一體化工藝。因素A、C、AB、A2、B2、C2對響應值的影響極顯著（＜0.01），因素AC、BC對響應值的影響顯著（＜0.05），因此各因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，所選因素之間存在顯著的交互作用。利用Design Expert 8.0軟件進行擬合，直觀了解各因素之間兩兩交互作用對加工工藝的影響，見圖2。

表3 Box-Behnken試驗設計方案與結果

試驗號ABC指標成分含量/（mg/g）Y X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11 11010.622 81.527 61.040 61.921 31.024 31.613 11.099 8 7.874 31.296 4 8.853 5 9.969 360.74 20000.758 13.115 41.932 02.820 71.703 92.638 22.519 313.918 62.079 410.543 212.949 196.06 30000.758 13.115 41.932 02.820 71.703 92.638 22.519 313.918 62.079 410.543 212.949 196.06 410-10.740 21.310 51.065 02.317 02.072 52.436 92.058 3 7.657 91.896 9 9.300 3 9.696 976.08 50000.758 13.115 41.932 02.820 71.703 92.638 22.519 313.918 62.079 410.543 212.949 196.06 6-1-100.702 71.986 11.556 41.477 31.388 12.159 52.077 110.705 31.747 3 8.892 711.183 075.49 7-10-10.636 82.166 41.565 02.335 81.156 22.916 71.899 810.974 21.393 311.595 112.254 180.29 81-100.754 72.067 11.695 21.611 61.786 62.718 72.077 8 7.986 91.557 8 7.715 5 8.762 775.66 90-1-10.797 12.540 71.328 32.646 51.916 42.382 32.321 110.667 01.955 511.483 112.806 388.81 10-1100.716 61.924 01.620 22.433 91.913 31.641 12.016 010.224 31.870 2 8.970 811.035 579.50 110-110.685 92.867 31.529 51.461 01.074 91.370 81.649 811.443 61.390 410.533 711.074 572.45 120000.758 13.115 41.932 02.820 71.703 92.638 22.519 313.918 62.079 410.543 212.949 196.06 13-1010.664 51.987 81.595 81.469 21.989 71.800 32.252 710.297 81.499 1 8.591 111.214 675.82 141100.692 41.421 60.980 21.900 71.150 41.998 11.575 7 7.481 21.383 6 8.810 0 9.150 963.84 150000.758 13.115 41.932 02.820 71.703 92.638 22.519 313.918 62.079 410.543 212.949 196.06 1601-10.815 42.246 61.519 32.460 02.069 42.438 81.853 810.794 91.876 211.508 212.174 286.93 170110.562 42.530 91.680 72.350 31.351 31.740 22.201 913.203 61.783 010.140 011.590 980.95

表4 回歸模型方差分析結果

來源平方和自由度均方F值P值 模型2069.05 9229.8956.20＜0.000 1 A151.21 1151.2136.970.000 5 B0.18 10.180.0430.841 1 C222.08 1222.0854.290.000 2 AB62.65 162.6515.320.005 8 AC29.54 129.547.220.031 2 BC26.94 126.946.590.037 2 A21043.81 11043.81255.18＜0.000 1 B2188.59 1188.5946.100.000 3 C2211.21 1211.2151.630.000 2 殘差28.63 74.09 失擬項28.63 39.54 誤差0 40 總離差2097.6816

2.2.3 最佳工藝條件預測與驗證

根據Design Expert 8.0軟件分析計算，大黃加工的最佳工藝為：含水量34.50%，切制規格2.47 mm，干燥溫度58.19 ℃，理論得分為97.24。為方便試驗操作，將最佳工藝修正為：含水量35%，切制規格2.5 mm，干燥溫度60 ℃。采用上述工藝參數，進行3次平行試驗，結果綜合評分為96.18，與理論預測值的偏差為1.08%，具有良好的吻合度。

圖2 含水量、切制規格和干燥溫度對綜合評分的交互作用響應面圖

3 討論

蒽醌類成分是大黃的重要活性成分，具有多種生物活性和藥理作用。鑒于2015年版《中華人民共和國藥典》以總蒽醌和游離蒽醌作為指標評價大黃飲片質量，本研究以蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷等11種成分為指標，可全面、綜合地評價大黃質量，優選大黃的產地加工炮制一體化工藝。

大黃為臨床常用藥，廣泛用于內、外、婦、兒、骨傷科等多種疾病，其產地初加工問題不容忽視。本試驗應用現代科學技術將大黃產地加工與炮制有機結合，有效解決了由于大黃藥材根部粗大而難以干燥的問題，最大程度減少因2次干燥、2次浸潤導致有效成分流失的問題，減少藥材中間貯藏和加工環節，降低人力物力和生產成本。與傳統熏干方法比較，可節約能源，減少污染，達到綠色經濟生產的目的。本研究優選的大黃產地加工炮制一體化工藝簡單、可靠，可為中藥飲片生產提供新的思路。

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Study on Integrative Technology of Primary Processing for Rhei Radix et Rhizoma Based on Response Surface Methodology

XIN Erdan1,2, SI Xinlei1,2, BIAN Tiantian1,2, NIU Jiangtao1,2, ZHANG Yugui1,2,ZHANG Shujuan1,2, LI Yuefeng1,2

To optimize the integrative technology of primary processing for Rhei Radix et Rhizoma by response surface methodology.Taking the comprehensive scores of 11 kinds of chemical components such as aloe-emodin-8-O-glucoside in Rhei Radix et Rhizoma as the indexes of investigation, and taking the water content, cutting specifications and drying temperature as the factors of investigation, Box-Behnken design was used to optimize the integrative technology of primary processing for Rhei Radix et Rhizoma.Optimum integrative technology of primary processing was as follows: water content 35%, cutting size 2.5 mm, drying temperature 60 ℃.The optimized integrative technology of primary processing of Rhei Radix et Rhizoma is easy and feasible, with high accuracy, which can be used for integrative technology of primary processing of Rhei Radix et Rhizoma.

response surface methodology; Rhei Radix et Rhizoma; integrative technology of primary processing; HPLC

R283.3

A

1005-5304(2020)05-0053-05

10.3969/j.issn.1005-5304.201907123

國家自然科學基金（81960713）；甘肅省自然科學基金創新基地和人才計劃（18JR3RA197）；甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室開放基金（ZYZL18-008）；甘肅中醫藥大學研究生創新基金（CX2019-16）

李越峰，E-mail：lyfyxk@126.com

（2019-07-09）

（2019-07-31；編輯：陳靜）