影響雞蛋中膽固醇提取因素的探討

鮑艷霞，王 鳳，肖 倩，葛津瑞

（鎮(zhèn)江市高等專科學(xué)校，江蘇鎮(zhèn)江 212003）

在全民健康的今天，膽固醇是個(gè)經(jīng)久不衰的話題，它可調(diào)節(jié)腸胃消化道中膳食脂肪的吸收，具有重要的生理功能，但如果攝入量過(guò)多，可形成高血脂癥，引起動(dòng)脈粥樣硬化，進(jìn)而誘發(fā)冠心病、高血壓等一系列心腦血管疾病。雞蛋是老百姓生活不可缺少的食材，雞蛋中的膽固醇可能更易導(dǎo)致人體血清膽固醇水平的提高。因此，在養(yǎng)生健康主題的今天，雞蛋中膽固醇含量測(cè)定的方法及準(zhǔn)確性是評(píng)定其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要參數(shù)。

目前有多種測(cè)量膽固醇的方法，如比色法[1]、高效液相色譜法[2]等，其中比色法出現(xiàn)較早、應(yīng)用較廣，是一種經(jīng)典方法，主要用于食品中膽固醇的測(cè)定，在測(cè)定一些食品如雞蛋中膽固醇時(shí)往往需要先進(jìn)行預(yù)處理，探討了用比色法測(cè)定雞蛋膽固醇含量相關(guān)處理?xiàng)l件對(duì)測(cè)定的影響。

1 材料與試劑

雞蛋，市售食品級(jí)；膽固醇溶液（標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備液）、鐵礬顯色液、氫氧化鉀、無(wú)水乙醇、石油醚、甲醇，均為分析純；實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備、分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴。

測(cè)定樣品膽固醇：根據(jù)不同樣品中膽固醇的含量決定取樣量。準(zhǔn)備容量為25 mL的試管，將所稱取的樣本加入其中。準(zhǔn)備無(wú)水乙醇4 mL，加入到上述試管當(dāng)中。準(zhǔn)備氫氧化鉀，質(zhì)量分?jǐn)?shù)要求為50%，容量要求為0.5 mL，同樣加入到試管當(dāng)中，充分進(jìn)行反應(yīng)。恒溫水浴進(jìn)行皂化，溫度 65℃，時(shí)間1 h。在此過(guò)程中要定時(shí)振搖，間隔20～30 min，直到完全，取出后冷卻。準(zhǔn)備5%氯化鈉，容量要求為3 mL，加入到冷卻的試管中；準(zhǔn)備石油醚，容量要求為10 mL，同樣加入到上述試管當(dāng)中，蓋緊玻璃塞，振搖，時(shí)間要求為2 min。完成后靜置，超過(guò)1 h，直至分層[3]。

上層為石油醚，將其取出放置在比色管內(nèi)，后者要求容量為10 mL，進(jìn)行溫水浴，溫度65℃，同時(shí)用氮?dú)獯蹈伞?zhǔn)備冰乙酸4 mL，加入到比色管內(nèi)；準(zhǔn)備鐵礬顯色液2 mL，同樣加入到比色管內(nèi)，搖勻，靜置，時(shí)間15 min，于波長(zhǎng)460～640 nm處比色。

將3 g蛋黃溶液準(zhǔn)確放入25 mL比色管中，溶于蒸餾水中并搖勻。

2 試驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[4]

準(zhǔn)備膽固醇溶液，質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，將甲醇加入其中，稀釋形成膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，此時(shí)質(zhì)量濃度為 0.10 mg/mL。分別吸取 0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL（即膽固醇 0，50.0，100.0， 200.0，300.0，400.0，500.0 μg） 至 25 mL 比色管中，用2 mL甲醇稀釋，然后沿壁緩慢加入2 mL硫磷鐵顯色劑，迅速搖勻，冷卻至室溫，加水稀釋至25 mL[5-6]。準(zhǔn)備甲醇組做空白試驗(yàn)，于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定吸光度，獲得相應(yīng)數(shù)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 顯色劑用量試驗(yàn)

稱取3 g蛋黃液，根據(jù)上述操作步驟在60℃水浴中皂化1 h，按1∶10的料液比加入石油醚提取1 h，提取液在60℃下?lián)]干，殘液加入2 mL甲醇溶液1.0，1.5，2.0，2.5硫磷顯色劑，沿管壁加入，立即搖勻，保證足夠熱量，溫度超過(guò)80℃，確保顯色完全[7-8]。冷卻至室溫后，于波長(zhǎng)550 nm處使用分光光度計(jì)比色法測(cè)定溶劑空白。確定顯色劑的用量[9]。

2.3 樣品處理?xiàng)l件試驗(yàn)

2.3.1 料液比的影響

稱取3 g蛋黃液，根據(jù)上述操作步驟在60℃水浴中1 h皂化，分別根據(jù)料液比1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14依次加入石油醚，于30℃下水浴提取1 h，提取液在60℃下?lián)]發(fā)干燥后測(cè)定，計(jì)算膽固醇的含量，確定最佳料液比。

2.3.2 提取溫度的影響

在60℃的水浴中1 h皂化后準(zhǔn)確稱取3 g蛋黃液。在25℃下加入10 mL石油醚，分別在35，45，55℃水浴中提取1 h，提取液于60℃條件下?lián)]發(fā)干燥并測(cè)定，計(jì)算出膽固醇的含量，確定最佳提取溫度。

2.3.3 提取時(shí)間的影響

在60℃水浴中1 h皂化后準(zhǔn)確稱取3 g蛋黃液，用10 mL石油醚在30℃水浴中提取0.5，1.0，1.5，2.0 h，于60℃條件下?lián)]發(fā)干燥測(cè)定提取物，計(jì)算甾醇的含量，確定最佳提取時(shí)間。

2.3.4 干燥溫度的影響

3 g蛋黃溶液是于60℃水浴中1 h皂化后精確稱取，通過(guò)加入1∶10石油醚提取1 h。提取溶液于50，55，60，70℃處測(cè)定，計(jì)算膽固醇含量，確定最佳擺桿的溫度。

2.4 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)備1～2個(gè)雞蛋，要求為同一品種，隨機(jī)選擇，打開取出蛋黃，制成勻漿。根據(jù)上述程序開展5個(gè)平行試驗(yàn)，定時(shí)測(cè)量膽固醇含量，使用分光光度計(jì)，每次間隔5 min分析最終結(jié)果。

2.5 進(jìn)行相同的對(duì)比試驗(yàn)

獲得6個(gè)蛋黃漿樣品，根據(jù)上述操作步驟中提取膽固醇的方法，計(jì)算各提取物的吸光度，膽固醇含量的定量檢測(cè)，重復(fù)性試驗(yàn)和RSD的計(jì)算。

2.6 回收率測(cè)試

使用0.15 g蛋黃溶液測(cè)定膽固醇含量，平行5次，加入2.5 mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)上述操作步驟測(cè)量膽固醇含量并計(jì)算RSD的回收率。

3 結(jié)果與分析

3.1 吸收曲線的繪制

吸取2 mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液，操作和試驗(yàn)方法將于不同波長(zhǎng)460～640 nm處以甲醇溶液與硫磷鐵顯示劑測(cè)定吸光度，結(jié)果表明膽固醇于波長(zhǎng)550 nm處的最大吸收，所以試驗(yàn)使用550 nm波長(zhǎng)。

3.2 顯色劑用量試驗(yàn)

吸收曲線見圖1，顯色劑用量與吸光度的關(guān)系見圖2。

可見，顯色劑用量在2.0～3.5 mL內(nèi)測(cè)定結(jié)果變化不大，取2.0 mL為最佳，因此試驗(yàn)選擇顯色劑用量取2.0 mL。

3.3 提取條件

3.3.1 料液比的影響

料液比1∶6，1∶8，1∶10，1∶12使用相同的方法提取和測(cè)定雞蛋中的膽固醇含量。

膽固醇含量與料液比關(guān)系的吸收曲線見圖4。

由圖4可知，料液比與膽固醇提取溶劑的量呈正比。當(dāng)材料以10 mL的比例增加時(shí)，增加溶劑用量對(duì)提取膽固醇的影響并不大，可以減少溶劑的使用。

3.3.2 提取時(shí)間的影響

膽固醇含量與提取時(shí)間的關(guān)系見圖5。

在0.5，1.0，1.5 h后提取卵漿后，從圖5可以看出膽固醇含量的變化。在0.5 h內(nèi)，提取的膽固醇與提取時(shí)間呈正比。1 h膽固醇的提取率為2 h的提取率的103%，證明了提取時(shí)間為1 h時(shí)膽固醇的提取過(guò)程基本完成。為了減少試驗(yàn)誤差的提取，提取時(shí)間應(yīng)該是1 h。

3.3.3 提取溫度的影響

膽固醇含量與提取溫度的關(guān)系見圖6。

由圖6可知，提取溫度分別在25，35，45，55℃，提取時(shí)間為1 h時(shí)測(cè)定蛋漿的膽固醇含量。隨著溫度的升高，膽固醇的提取率先增加然后下降，并在35℃時(shí)達(dá)到最大值。

3.3.4 揮干溫度的影響

將膽固醇提取液分別于50，55，60，65，70℃條件下?lián)]干后，測(cè)得膽固醇含量。

膽固醇含量與揮干溫度關(guān)系的吸收曲線見圖7。

以60℃為界，低于這一溫度時(shí)，溫度與膽固醇提取率呈正相關(guān)，高于這一溫度時(shí)二者呈負(fù)相關(guān)，60℃時(shí)，采用這一溫度進(jìn)行試驗(yàn)。

3.4 精密度試驗(yàn)

隨機(jī)抽取同一品種1～2個(gè)雞蛋打破并分離蛋清，得到蛋黃液勻漿，同法操作平行測(cè)定6次。

精密度與重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表1。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

表1 精密度與重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

準(zhǔn)確稱取6 g的蛋黃液勻漿樣品，根據(jù)上述步驟提取膽固醇的方法，結(jié)果列于表1中。由表1可知，6次平行試驗(yàn)中每個(gè)蛋黃的平均膽固醇含量為1 613 mg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.09%，這證明試驗(yàn)重現(xiàn)性高。

3.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)備已測(cè)定膽固醇含量蛋黃液，對(duì)其進(jìn)行測(cè)量，共5份，進(jìn)行回收試驗(yàn)[10]。測(cè)得平均回收率為95.41%，RSD為3.77%。

加標(biāo)回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)

3.7 樣品測(cè)定

在料液比1∶10，提取時(shí)間1 h，提取溫度35℃，蒸發(fā)溫度65℃下提取后分別對(duì)白殼、綠殼雞蛋進(jìn)行測(cè)定。

樣品測(cè)定結(jié)果見表3。

由表3可知，綠殼的雞蛋與白殼的雞蛋中所含膽固醇含量相似。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

蛋黃中膽固醇的最佳提取條件為料液比1∶10，提取時(shí)間1 h，提取溫度35℃，蒸發(fā)溫度65℃，每蛋黃中膽固醇含量為1 592 mg。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求不高、精度高[11]。因此，測(cè)量蛋黃膽固醇含量的方法快速有效。