復烤煙葉DNA提取條件優化

吳時璽，焦凱旋，侯寧寧，胡騰飛，黃啟蒙，李 萌，馬 林

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450000；2.浙江中煙工業有限責任公司技術中心，浙江杭州 310004）

0 引言

煙葉經不同程度的加工處理后，基因組DNA降解嚴重，提取的DNA產量和質量均不理想，解決此類問題，就需要對煙葉DNA的提取方法進行適當的改進，以獲得品質高且適于后續試驗需要的DNA。目前，提取DNA的方法有10多種，但效果各異[1-8]。聶瓊等人[9]認為，目前應用于煙草總DNA的提取方法，步驟比較繁瑣且所需周期較長。鞏艷紅等人[10]曾指出，由于不同的植物和植物自身的不同部位都各具特點，如細胞壁較厚、含酚類、含糖類物質多，很難用同一種方法去提取不同植物的DNA。何雪嬌等人[11]認為，煙草不同內在成分的差異，能夠直接影響DNA的提取質量，采用常規的方法很難達到理想的效果。易慶平等人[12]認為DNA提取步驟較為復雜且耗時較長，采用不同的采樣時期、貯藏方法、DNA提取純化方法等都會對DNA提取質量造成較大的影響。針對不同的研究目的，對DNA純度和產量的要求也不同。所以，應根據不同的植物特征采用不同的方法對其DNA進行提取。影響煙葉DNA提取的因素除了煙草本身的影響外，還有許多其他方面的影響，如不同的提取方法、不同的試驗步驟等。任如意等人[13]認為，基因組DNA的濃度（DNA產量）在很大程度上取決于煙葉細胞的破碎程度，通過采取不同的試驗轉速及不同的樣品研磨次數，進而使新鮮煙葉和復烤煙葉都能進行充分的研磨，進而提高DNA產量。王桂蛾等人[14]認為，采用不同純化及沉淀方法能影響DNA產率和品質，不同的沉淀溶劑的使用目的是為了使DNA與其他化合物分離開，從而提高DNA的純凈度。試驗中影響DNA的產量和質量的影響因素還有很多，需不斷地對試驗條件進行優化，選取最優的條件提取煙草DNA，達到提高DNA的產量和質量。Gadani F等人[15]建立的改良CTAB法提取烤后煙葉基因組DNA。但檢測結果波動較大，特別是對于保存時間較長的烤后煙葉，上述方法很難提取到主條帶單一的基因組DNA。

對CTAB法進一步進行改良，通過對提取條件中的樣品研磨方式、裂解時間、離心轉速、洗滌劑選擇4個主要影響因素進行單因素優化，并通過PCR技術檢測基因組DNA的可用性，力求找到提高DNA質量和含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

常用復烤煙草品種紅花大金元、云煙85、云煙87、K326等，云南中煙工業公司提供；新鮮煙葉種子，各大中煙提供。

1.1.2 試劑

EDTA、EDTA2Na、NaCl、CTAB、PVP、β - 巰基乙醇、三氯甲烷、異戊醇、無水乙醇、溴化乙錠、瓊脂糖等試劑，均為分析純，天津大茂化學試劑廠提供；RNA消化酶（RNase），南京諾唯贊生物科技有限公司提供。

1.1.3 儀器

JXSF TPRP-24型組織研磨儀，上海凈信實業發展有限公司產品；Thermo Scientific Heraeus MicroCL 17型微量離心機、NanoDrop ND-2000C型超微量分光光度計，賽默飛世爾科技公司產品；Vetiti型梯度PCR儀，美國ABI公司產品；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠產品；Mini Bis Pro型凝膠成像分析系統，以色列DNR凝膠成像系統有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 新鮮煙葉DNA提取

取0.1 g新鮮煙葉置于1.5 mL離心管中，使用組織研磨儀磨成粉末，再用CTAB法提取煙草基因組DNA，提取的DNA于-20°下保存備用。

1.2.2 復烤煙葉DNA提取

取0.1 g復烤煙葉置于1.5 mL離心管中，使用組織研磨儀磨成粉末，再用CTAB法提取煙草基因組DNA，提取的DNA于-20°下保存備用。

1.2.3 復烤煙葉DNA提取優化

對復烤煙葉（以紅花大金元為主）DNA提取過程中的樣品研磨方式、水浴時間、離心轉速、洗滌劑選擇這4個主要影響因素進行單因素條件優化，找出最優提取條件，縮小與新鮮煙葉DNA的差異，滿足后續試驗要求。

1.2.4 煙草基因組DNA質量檢測

所提取的新鮮煙葉基因組DNA和復烤煙葉基因組DNA的質量濃度分別進行1.5%的瓊脂糖凝膠檢測和超微量分光光度檢測。根據OD260/OD280的比值即可判斷所提DNA的純度。OD260/OD280的比值為1.8～2.0說明所提的DNA無降解現象，代表著蛋白質及多糖等物質去除較為徹底；若OD260/OD280＞2.0，則說明有RNA的污染；若OD260/OD280＜1.8，則說明有蛋白質的污染。

1.2.5 PCR檢測

PCR反應體系：20 μL體系，50 ng/μL模板DNA 1 μL，2×Taq plus Master mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，ddH2O補充至20 μL。PCR反應程序：預變性94℃，6 min；變性94℃，50 s；退火38℃，30 s，延伸72℃，90 s，40個循環；終延伸：72℃，6 min，4℃保溫。取3 μL擴增產物上樣于1.5%的瓊脂糖凝膠中，80 V恒壓電泳40 min后，紫外凝膠成像儀拍照。

2 結果與分析

2.1 改良CTAB法提取新鮮煙葉和復烤煙葉基因組DNA結果比較

新鮮煙葉基因組DNA凝膠電泳圖見圖1，4種新鮮煙葉基因組DNA質量濃度和純度檢測結果見表1。

表1 4種新鮮煙葉基因組DNA質量濃度和純度檢測結果

由圖1可知，利用CTAB法提取的新鮮煙葉基因組DNA主條帶很清楚，無明顯雜帶，點樣孔周圍基本沒有發亮物質。由表1可知，提取的4種新鮮煙葉基因組DNA OD260/OD280的比值為1.8～2.0，DNA純度較高，質量濃度也較大，符合后續試驗要求。

復烤煙葉基因組DNA凝膠電泳圖見圖2。

由圖2可知，所提取的復烤煙葉DNA主條帶不清晰，點樣孔周圍發亮，條帶彌散切拖尾嚴重。說明其內含有大量RNA、蛋白質、多糖、多酚、鹽類等雜質。目前的CTAB法對復烤煙葉DNA提取不合適，需要進一步優化DNA提取條件，去除這些雜質對DNA純度和含量的影響。

2.2 復烤煙葉基因組DNA提取方法優化

2.2.1 復烤煙葉研磨次數優化

復烤煙葉研磨次數優化的瓊脂糖凝膠電泳分析見圖3。

由圖3可知，DNA主條帶的完整性明顯較差，均存在不同程度的雜質污染。研磨2次和研磨3次的DNA主條帶相比研磨1次和研磨4次主條帶清晰，效果較好。

不同研磨次數對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析見表2。

表2 不同研磨次數對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析

由表2可知，無論研磨幾次，OD260/OD280的比值均滿足試驗要求，但OD260/OD230的比值均較低，都存在著不同程度的小分子鹽類對其影響。相比之下，研磨2次的OD260/OD230最接近2.0，較符合要求。故綜合圖3和表2中數據得到結論：在研磨儀頻率為65 Hz，120 S的條件下，研磨2次提取的煙葉DNA效果好于研磨1次，3次，4次。

2.2.2 復烤煙葉轉速優化

復烤煙葉轉速優化的瓊脂糖凝膠電泳分析見圖4。

由圖4可知，樣品1、2含有嚴重的拖尾現象，看不到DNA主條帶。樣品3有明顯的DNA主條帶，但也有輕微拖尾現象。

不同轉速對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析見表3。

表3 不同轉速對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析

由表3可知，OD260/OD280均為1.8～2.0，說明其內酚類和蛋白質去除較為完全，但是OD260/OD230的比值均低于2.0，這說明其內有殘存的小分子或者鹽類的影響。隨著轉速的提高，OD260/OD230依次增高，由于該比值在2.0左右才滿足試驗要求，從表3可知轉速為9 000 r/min時試驗結果最符合要求。故認為轉速為9 000 r/min時效果最佳。

2.2.3 復烤煙葉水浴時間優化

復烤煙葉水浴時間優化的瓊脂糖凝膠電泳分析見圖5。

由圖5可知，提取的煙葉基因組均能得到清晰的DNA主條帶，但水浴25，35 min的DNA主條帶亮度較弱，完整性較差，有拖尾現象；水浴30，40 min所提DNA主條帶清晰，點樣孔附近有很少量蛋白質殘留，效果較好。

水浴時間對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析見表4。

表4 水浴時間對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析

由表4可知，無論水浴25，30，35，40 min，OD260/OD280的比值都能滿足試驗的要求均在1.95左右，而OD260/OD230唯有在65℃下水浴30 min才能在2.0左右（根據查閱文獻，該比值在2.0左右DNA的純凈度較高）。故綜合圖5及表4中數據得到結論，采用水浴時間為30 min提取的煙葉DNA的效果好于水浴 25，35，40 min。

2.2.4 復烤煙葉洗滌劑優化

復烤煙葉洗滌劑優化的瓊脂糖凝膠電泳分析見圖6。

由圖6可知，1號樣品無明顯DNA主條帶，且拖尾嚴重。2，3，4中可以看到明顯的DNA主條帶，但只有3號樣品有輕微的拖尾現象，點樣孔附近殘留的蛋白質最少，故樣品3的效果最佳，即采用70%乙醇進行DNA除雜效果最為明顯。

采用不同的洗滌劑對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析見表5。

表5 采用不同的洗滌劑對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析

由表5可知，采用無水異丙醇及無水乙醇處理樣品的OD260/OD230偏低，有較多的小分子或者鹽類雜質的存在。相比較，由OD260/OD230的比值可看出采用70%異丙醇和70%乙醇處理的鹽類雜質較少，但從DNA電泳結果可看出，70%異丙醇處理的DNA主條帶不清晰且拖尾嚴重，不能滿足試驗的需求。故綜合表5及圖6得出結論，采用70%的乙醇處理所獲得的DNA的純凈度最好且質量濃度較高。

2.3 PCR檢測

為了考查進一步優化后的CTAB法對復烤煙葉基因組DNA的可用性，用引物28、W11進行PCR擴增。

PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳分析結果（引物S28） 見圖7，PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳分析結果（引物w11） 見圖8。

由圖7～圖8可知，4種不同的煙葉品種經過PCR擴增后，均能從瓊脂糖凝膠電泳中看出有明顯的擴增條帶，說明提取的DNA能夠很好地滿足后續PCR對模板DNA的要求，即用進一步改良后的CTAB法提取煙草DNA的方法是可行的。

3 結論

通過對CTAB法提取植物基因組DNA過程中的研磨方式、裂解時間、離心轉速、洗滌劑選擇，這4個主要影響因素進行單因素優化。結果表明，采用65 Hz于120 s條件下研磨2次；以轉速9 000 r/min對樣品進行離心；水浴時間30 min及70%乙醇作為洗滌劑。在該優化條件下所提煙葉的DNA質量濃度和含量較之前有較大提升，可滿足后續PCR試驗要求。

除此之外，試驗中發現適當的加大PVP、β-巰基乙醇的用量，其DNA提取效果更佳，主帶條清晰、無拖尾現象，純度較高且OD260/OD280的比值為1.8～2.0，OD260/OD230為2.0左右，能夠滿足后續PCR試驗對DNA模板的要求。通過多次重復試驗驗證，進一步優化后的CTAB法提取的煙葉DNA結果穩定。但不同品種間提取的DNA效果可能存在些許差異，需要適當地增減β-巰基乙醇的用量才可達到更好的提取條件。

與新鮮煙葉相比，提取的復烤煙葉基因組DNA效果不佳，分析原因可能是：①試驗材料的差異。健康、新鮮、幼嫩的煙草葉片細胞正處于分裂期，含有較多完整的DNA，并且代謝物較少，是理想的植物DNA提取材料。煙葉經過復烤之后，存在較多的多糖、多酚等代謝產物，會使DNA的提取純度降低，并且其DNA的完整性也遭到不同程度的破壞，這對后期的DNA提取更加困難。②煙葉研磨方式。新鮮的煙葉其組織細胞有一定的韌性，液氮研磨或者組織研磨器研磨對DNA基本沒有損傷；煙葉經過復烤之后，其內的組織、細胞變得更加脆弱，外部的機械力量會加速研磨過程中DNA的降解，使得完整的DNA鏈斷開。③水浴過程。新鮮煙葉包裹著DNA的細胞壁較為堅韌，通常水浴40～50 min才可以將細胞壁完全破裂開來，使內部的DNA完全裸露出來；復烤后的煙葉其細胞壁經過打葉復烤過程的加工后已經變得比較脆弱，此時只用水浴20～30 min即可，若水浴時間過長則會使DNA完全降解，導致最終無法提取出煙葉DNA。④離心過程。新鮮煙葉的DNA因未經外部高強度力量的破壞，DNA鏈可經受高轉速離心；復烤后的煙葉高轉速的離心力會使得完整的DNA鏈破碎成小片段，從而導致最終提的DNA條帶模糊，含量較低。⑤洗滌劑差異。對于新鮮煙葉來說，其DNA鏈較為完整，洗滌劑對DNA提取沒有影響，即哪種洗滌劑都可；對于復烤煙葉來說，其DNA鏈存在著不同程度的破壞，對于洗滌劑的要求較高，試驗后發現用70%的無水乙醇對DNA進行洗滌效果好于其他洗滌劑。