固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香菌株篩選分析研究

胡騰飛，焦凱旋，黃啟蒙，吳時璽，侯寧寧，李 萌，馬 林

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001；2.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，浙江杭州 310004）

微生物發(fā)酵可有效降解煙草中的大分子，通常這些大分子對煙草的抽吸品質(zhì)是不利的[1-2]。近年來，隨著微生物技術(shù)的發(fā)展，更多學(xué)者重視對煙草有益微生物的篩選和應(yīng)用研究，利用有益微生物對煙草進行發(fā)酵。微生物發(fā)酵產(chǎn)香是獲取天然香料的較好方法[3]，郭林青等人[4]從巨峰葡萄表皮分離篩選得到一株能夠使煙末發(fā)酵液產(chǎn)生明顯花香韻和甜香韻的酵母菌株YG-4，對煙末進行發(fā)酵來改變其特征香味，以期為后續(xù)進行配方香料優(yōu)化提供幫助和依據(jù)。劉麗芬等人[5]從香茅草中分離出菌株XCJ-1，其發(fā)酵液具有清甜香和花香，制成生物香料進行煙草加香，評吸發(fā)現(xiàn)具有增加煙香、降低刺激性、改善煙氣質(zhì)等作用。但利用有益菌株對難以直接應(yīng)用于配方的煙葉進行發(fā)酵的研究相對較少，在基本不降低煙草物理特性的基礎(chǔ)上，通過人工固態(tài)發(fā)酵改善煙葉品質(zhì)。

以實驗室液態(tài)發(fā)酵較好的3株產(chǎn)香菌株為試驗菌株，通過微生物固態(tài)發(fā)酵，研究3株產(chǎn)香菌固態(tài)發(fā)酵對煙葉的增香作用，通過對煙葉香氣總量和對煙葉進行的感官評吸結(jié)果，綜合篩選出能夠在固態(tài)發(fā)酵中對煙草增香提質(zhì)的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

平頂山上部煙葉，河南中煙技術(shù)中心提供。

芽孢桿菌（Bacillus pumilus strain）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、漢遜酵母（Hanseniaspora.sp），課題組分離并保存。

葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉，無水硫酸鉀純度均為AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；色譜級二氯甲烷，山東禹王和天下新材料有限公司提供；HP6890/5976型GC/MS氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司產(chǎn)品；滾筒式固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)艙，鄭州輕工業(yè)大學(xué)煙草生物技術(shù)課題組共同研制完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的組成及配制

（1） 芽孢桿菌培養(yǎng)基。酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH值自然，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，于121℃下滅菌30 min，儲存于超凈工作臺中備用。

（2） 酵母培養(yǎng)基。酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH值自然，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，于115℃下滅菌30 min，儲存于超凈工作臺中備用。

1.2.2 煙葉發(fā)酵

取適量的平頂山煙葉放入固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)艙中，將生長為對數(shù)期的菌液以15%的接菌量均勻噴至煙葉表面（以干煙葉質(zhì)量計），補充水分至煙葉初始含水率為35%，調(diào)節(jié)發(fā)酵艙的溫濕度，使整個發(fā)酵過程煙葉含水率保持在35%，發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵艙轉(zhuǎn)速4 r/min，發(fā)酵時長24 h。

1.2.3 煙葉發(fā)酵致香成分分析

表1 發(fā)酵煙葉致香成分分析

準(zhǔn)確稱取15 g制備的待測樣品，萃取劑為二氯甲烷，在60℃下進行2.5 h的蒸餾萃取。然后進行水浴濃縮，加入1 mL的乙酸苯乙酯（0.726 4 mg/mL）作為內(nèi)標(biāo)，濃縮蒸發(fā)至1 mL，過0.22 μm濾膜于2.0 mL的色譜瓶中，隨后立即進行GC/MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

（1） GC條件。色譜柱HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm），進樣口溫度280℃，載氣He，溶劑延遲5 min，進樣量1 μL，分流比15∶1，程序升溫為初始溫度50℃，6℃/min升至280℃保持10 min。

（2） GC/MS條件。采用MSD檢測器，其他GC條件同上；載氣He，傳輸線溫度280℃，EI電子能源70 eV，倍增器電壓1 450 V，質(zhì)量掃描范圍為全掃描，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 致香成分分析

發(fā)酵煙葉致香成分分析見表1，發(fā)酵后煙葉各組分致香總量分析見表2，各組分致香成分總量見圖1。

表2 發(fā)酵后煙葉各組分致香總量分析

由表1可以得出，從致香成分總量來看，利用3株產(chǎn)香菌固態(tài)發(fā)酵后煙葉的致香成分與對照組相比均有不同程度的增加，菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香能力依次為漢遜酵母＞釀酒酵母＞芽孢桿菌，其中經(jīng)漢遜酵母發(fā)酵的煙葉致香成分總量最高且達到149.99 μg/g，芽孢桿菌發(fā)酵的煙葉的致香成分總量最低為110.30 μg/g；從致香成分上看，成分變化不大，主要體現(xiàn)在單個成分含量上發(fā)生變化。

由表2和圖1可以得出，在4組處理中，致香成分中酮類占香氣總量的78.2%～88.6%，在香氣成分中占較大比例，酮類本身具有較強的香氣貢獻，是煙草和煙氣中中性致香成分的最主要組成[6]，酮類組分漢遜酵母＞釀酒酵母＞對照＞芽孢桿菌；醛類和酯類組分，釀酒酵母組多于對照組，主要是糠醛、苯乙醛、二氫獼猴桃內(nèi)酯、5-甲基糠醛，這些都是煙草中重要的香氣成分。

2.2 不同產(chǎn)香菌株致香成分總量顯著性分析

為篩選出煙草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香較好的菌株，分別選用3株產(chǎn)香菌株進行固態(tài)發(fā)酵試驗，每個試驗重復(fù)3次，判斷不同菌株發(fā)酵對致香成分總量是否具有顯著影響。

不同處理對致香成分總量影響的方差分析見表3，不同處理下的致香成分見表4。

表3 不同處理對致香成分總量影響的方差分析

由表3可以得出，在進行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香菌株篩選試驗中，不同處理間即3組試驗組與對照組中組間顯示極顯著差異，每組試驗重復(fù)3次，各組間顯示差異不顯著，即不同處理對煙葉致香成分的影響極顯著。

由表4可以得出，對照組致香成分為108.72±1.76 μg/g，芽孢桿菌組致香成分為 110.30±2.85 μg/g，漢遜酵母組致香成分為149.99±2.86 μg/g，釀酒酵母組致香成分為128.08±2.30 μg/g；對照組與芽孢桿菌組的煙葉在致香成分上存在差異不顯著，與漢遜酵母組和釀酒酵母組的煙葉在致香成分上存在差異極顯著，芽孢桿菌組與對照組煙葉在致香成分上差異不顯著，與漢遜酵母組和釀酒酵母組存在差異極顯著，漢遜酵母與對照組、芽孢桿菌組和釀酒酵母組煙葉在致香成分上均存在差異極顯著，釀酒酵母組與對照組、芽孢桿菌組和漢遜酵母組煙葉在致香成分上均存在差異極顯著。

表4 不同處理下的致香成分/μg·g-1

2.3 感官品質(zhì)評價

將對照煙葉和發(fā)酵后的煙葉卷制，以邊評吸邊交流的方式進行評分。

感官評吸見表5。

表5 感官評吸/分

由表5可以得出，芽孢桿菌發(fā)酵后的煙葉，評吸結(jié)果與對照組相比分值略有下降，雜氣略大，燃燒性差；釀酒酵母發(fā)酵后的煙葉，評吸結(jié)果在香氣量上分值有所提升，雜氣略大，對改善對照組的香氣量是有顯著作用；漢遜酵母發(fā)酵后的煙葉，評吸結(jié)果在香氣質(zhì)、香氣量分值均有所提高，刺激性也有所降低，對改善煙葉感官品質(zhì)有顯著作用。

3 結(jié)論

選取3株液態(tài)發(fā)酵較好的產(chǎn)香菌株，利用3株產(chǎn)香菌株分別進行人工固態(tài)發(fā)酵，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析發(fā)酵后煙葉的致香成分，并通過感官評吸，綜合得出漢遜酵母和釀酒酵母在固態(tài)發(fā)酵條件下對煙葉的感官品質(zhì)均具有改善作用，主要表現(xiàn)在香氣量上有明顯改善，其中漢遜酵母對香氣量的改善最為明顯，這與發(fā)酵后煙葉致香成分結(jié)果一致。

酵母[7-8]較多用于改善煙葉品質(zhì)，龍章德等人[8]研究了不同酵母接種量對改善煙葉品質(zhì)的影響，接種量可能直接影響了發(fā)酵后煙葉評吸雜氣略大，同時培養(yǎng)基也可能增加卷煙評吸的刺激性，后期可通過減少接種量對產(chǎn)香菌人工固態(tài)發(fā)酵改善煙葉品質(zhì)進行優(yōu)化。