固態發酵產香菌株篩選分析研究

胡騰飛，焦凱旋，黃啟蒙，吳時璽，侯寧寧，李 萌，馬 林

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450001；2.浙江中煙工業有限責任公司技術中心，浙江杭州 310004）

微生物發酵可有效降解煙草中的大分子，通常這些大分子對煙草的抽吸品質是不利的[1-2]。近年來，隨著微生物技術的發展，更多學者重視對煙草有益微生物的篩選和應用研究，利用有益微生物對煙草進行發酵。微生物發酵產香是獲取天然香料的較好方法[3]，郭林青等人[4]從巨峰葡萄表皮分離篩選得到一株能夠使煙末發酵液產生明顯花香韻和甜香韻的酵母菌株YG-4，對煙末進行發酵來改變其特征香味，以期為后續進行配方香料優化提供幫助和依據。劉麗芬等人[5]從香茅草中分離出菌株XCJ-1，其發酵液具有清甜香和花香，制成生物香料進行煙草加香，評吸發現具有增加煙香、降低刺激性、改善煙氣質等作用。但利用有益菌株對難以直接應用于配方的煙葉進行發酵的研究相對較少，在基本不降低煙草物理特性的基礎上，通過人工固態發酵改善煙葉品質。

以實驗室液態發酵較好的3株產香菌株為試驗菌株，通過微生物固態發酵，研究3株產香菌固態發酵對煙葉的增香作用，通過對煙葉香氣總量和對煙葉進行的感官評吸結果，綜合篩選出能夠在固態發酵中對煙草增香提質的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

平頂山上部煙葉，河南中煙技術中心提供。

芽孢桿菌（Bacillus pumilus strain）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、漢遜酵母（Hanseniaspora.sp），課題組分離并保存。

葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉，無水硫酸鉀純度均為AR，天津市大茂化學試劑廠提供；色譜級二氯甲烷，山東禹王和天下新材料有限公司提供；HP6890/5976型GC/MS氣質聯用儀，美國安捷倫公司產品；滾筒式固態發酵反應艙，鄭州輕工業大學煙草生物技術課題組共同研制完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的組成及配制

（1） 芽孢桿菌培養基。酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH值自然，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，于121℃下滅菌30 min，儲存于超凈工作臺中備用。

（2） 酵母培養基。酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH值自然，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，于115℃下滅菌30 min，儲存于超凈工作臺中備用。

1.2.2 煙葉發酵

取適量的平頂山煙葉放入固態發酵反應艙中，將生長為對數期的菌液以15%的接菌量均勻噴至煙葉表面（以干煙葉質量計），補充水分至煙葉初始含水率為35%，調節發酵艙的溫濕度，使整個發酵過程煙葉含水率保持在35%，發酵溫度31℃，發酵艙轉速4 r/min，發酵時長24 h。

1.2.3 煙葉發酵致香成分分析

表1 發酵煙葉致香成分分析

準確稱取15 g制備的待測樣品，萃取劑為二氯甲烷，在60℃下進行2.5 h的蒸餾萃取。然后進行水浴濃縮，加入1 mL的乙酸苯乙酯（0.726 4 mg/mL）作為內標，濃縮蒸發至1 mL，過0.22 μm濾膜于2.0 mL的色譜瓶中，隨后立即進行GC/MS氣相色譜-質譜聯用儀分析。

（1） GC條件。色譜柱HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm），進樣口溫度280℃，載氣He，溶劑延遲5 min，進樣量1 μL，分流比15∶1，程序升溫為初始溫度50℃，6℃/min升至280℃保持10 min。

（2） GC/MS條件。采用MSD檢測器，其他GC條件同上；載氣He，傳輸線溫度280℃，EI電子能源70 eV，倍增器電壓1 450 V，質量掃描范圍為全掃描，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃。

2 結果與分析

2.1 致香成分分析

發酵煙葉致香成分分析見表1，發酵后煙葉各組分致香總量分析見表2，各組分致香成分總量見圖1。

表2 發酵后煙葉各組分致香總量分析

由表1可以得出，從致香成分總量來看，利用3株產香菌固態發酵后煙葉的致香成分與對照組相比均有不同程度的增加，菌株固態發酵產香能力依次為漢遜酵母＞釀酒酵母＞芽孢桿菌，其中經漢遜酵母發酵的煙葉致香成分總量最高且達到149.99 μg/g，芽孢桿菌發酵的煙葉的致香成分總量最低為110.30 μg/g；從致香成分上看，成分變化不大，主要體現在單個成分含量上發生變化。

由表2和圖1可以得出，在4組處理中，致香成分中酮類占香氣總量的78.2%～88.6%，在香氣成分中占較大比例，酮類本身具有較強的香氣貢獻，是煙草和煙氣中中性致香成分的最主要組成[6]，酮類組分漢遜酵母＞釀酒酵母＞對照＞芽孢桿菌；醛類和酯類組分，釀酒酵母組多于對照組，主要是糠醛、苯乙醛、二氫獼猴桃內酯、5-甲基糠醛，這些都是煙草中重要的香氣成分。

2.2 不同產香菌株致香成分總量顯著性分析

為篩選出煙草固態發酵產香較好的菌株，分別選用3株產香菌株進行固態發酵試驗，每個試驗重復3次，判斷不同菌株發酵對致香成分總量是否具有顯著影響。

不同處理對致香成分總量影響的方差分析見表3，不同處理下的致香成分見表4。

表3 不同處理對致香成分總量影響的方差分析

由表3可以得出，在進行固態發酵產香菌株篩選試驗中，不同處理間即3組試驗組與對照組中組間顯示極顯著差異，每組試驗重復3次，各組間顯示差異不顯著，即不同處理對煙葉致香成分的影響極顯著。

由表4可以得出，對照組致香成分為108.72±1.76 μg/g，芽孢桿菌組致香成分為 110.30±2.85 μg/g，漢遜酵母組致香成分為149.99±2.86 μg/g，釀酒酵母組致香成分為128.08±2.30 μg/g；對照組與芽孢桿菌組的煙葉在致香成分上存在差異不顯著，與漢遜酵母組和釀酒酵母組的煙葉在致香成分上存在差異極顯著，芽孢桿菌組與對照組煙葉在致香成分上差異不顯著，與漢遜酵母組和釀酒酵母組存在差異極顯著，漢遜酵母與對照組、芽孢桿菌組和釀酒酵母組煙葉在致香成分上均存在差異極顯著，釀酒酵母組與對照組、芽孢桿菌組和漢遜酵母組煙葉在致香成分上均存在差異極顯著。

表4 不同處理下的致香成分/μg·g-1

2.3 感官品質評價

將對照煙葉和發酵后的煙葉卷制，以邊評吸邊交流的方式進行評分。

感官評吸見表5。

表5 感官評吸/分

由表5可以得出，芽孢桿菌發酵后的煙葉，評吸結果與對照組相比分值略有下降，雜氣略大，燃燒性差；釀酒酵母發酵后的煙葉，評吸結果在香氣量上分值有所提升，雜氣略大，對改善對照組的香氣量是有顯著作用；漢遜酵母發酵后的煙葉，評吸結果在香氣質、香氣量分值均有所提高，刺激性也有所降低，對改善煙葉感官品質有顯著作用。

3 結論

選取3株液態發酵較好的產香菌株，利用3株產香菌株分別進行人工固態發酵，通過氣相色譜-質譜聯用儀分析發酵后煙葉的致香成分，并通過感官評吸，綜合得出漢遜酵母和釀酒酵母在固態發酵條件下對煙葉的感官品質均具有改善作用，主要表現在香氣量上有明顯改善，其中漢遜酵母對香氣量的改善最為明顯，這與發酵后煙葉致香成分結果一致。

酵母[7-8]較多用于改善煙葉品質，龍章德等人[8]研究了不同酵母接種量對改善煙葉品質的影響，接種量可能直接影響了發酵后煙葉評吸雜氣略大，同時培養基也可能增加卷煙評吸的刺激性，后期可通過減少接種量對產香菌人工固態發酵改善煙葉品質進行優化。