精制竹醋與中藥提取物的抑菌增效作用分析

谷 瑤，李桂珍，溫如斯，楊 漓

（廣西壯族自治區林業科學研究院，廣西南寧 530002）

竹醋液是竹材熱解得到的液體產物，是一種組成成分相當復雜的深紅褐色液體混合物，其主要成分是水、有機酸、酚類、酮類、醇類等物質，pH值2.20～3.01，相對密度1.02左右，其成分隨著竹種、生產條件、收集方法、加工處理工藝、包裝、貯存運輸條件等的不同而不斷變化[1-3]。竹醋液在食品、醫藥、化工、農業、環保等領域有著非常廣泛的應用[4-6]。在食品加工方面，竹醋液主要用于熏制火腿和香腸，也可用作熏煙味的食品添加劑。竹醋液具有較強的熏香感和醋酸味，具有魚肉、保鮮、防止油脂、維A被氧化，防腐、殺菌的作用。但是，竹醋液含有大量的酚類物質，特有的竹焦油和醋酸影響了食品的風味，對食品安全也帶來一定影響。試驗旨在為竹醋液更好地應用于食品加工領域、減少化學殺菌劑的使用量，以及為研制低毒殺菌制劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

竹醋液原液、精制竹醋，桂林綠竹有限公司提供；厚樸、黃連、苦參、蛇床子、菖蒲及獨活，南寧萬藥堂藥業有限公司提供；中和劑選擇為含0.5%卵磷脂+0.5%組氨酸+1.0%吐溫-80的PBS溶液，上海酶聯生物科技有限公司提供；大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、白色念珠菌（C.albicans）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa） 第7～9代，中國科學院微生物菌種保藏中心提供；小白鼠、白色家兔，廣西醫科大學實驗動物中心提供；白色豚鼠，昆明醫科大學實驗動物中心提供；其他材料及試劑，南寧市藍天試驗器材有限公司提供。

1.2 儀器和設備

HH·B11·600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養箱，上海龍躍儀器設備有限公司產品；LRH-250A型生化培養箱，韶關市泰宏醫療器械有限公司產品；JY10001型電子天平，上海雙旭電子有限公司產品；HNW-S-6型電熱恒溫水浴箱，上海汗諾儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 中藥的提取

厚樸、黃連、苦參、蛇床子、菖蒲及獨活經烘干（60℃，8 h）粉碎后，分別稱取50 g溶于200 mL純化水中，微沸浸提1 h后，過濾收集濾液，抽真空狀態下旋轉蒸發并濃縮到50 g。

1.3.2 菌懸液的制備

細菌在細菌培養基斜面上于37℃下活化24 h，白色念珠菌在沙氏培養基斜面上于30℃下活化48 h，備用。將活化后的菌種用生理鹽水配置成105～110個/mL（血球計數法）的菌懸液，備用。

1.3.3 抑菌作用的測定

取樣品于超凈工作臺中，用無菌水配成體積分數不同的稀釋液。取50 μL菌懸液（細菌為1×106個/mL，真菌為1×105個/mL） 鋪板，將濾紙片放至平板中央，加30 μL樣品，以水作為對照組。適溫培養（細菌于37℃下培養，白色念珠菌于28℃下培養），待對照長滿后，測量抑菌圈直徑。

1.3.4 殺菌作用的測定

每支試管加入2.5 mL配置好的樣品（培養基混合物），然后再加入0.5 mL菌懸液（細菌1×107個/mL、白色念珠菌1×107個/mL），充分振蕩后，搖床培養。培養條件為細菌溫度37℃，轉速150 r/min；白色念珠菌溫度28℃，轉速150 r/min，培養24 h；取50 μL菌液涂板，待對照組長滿板后，觀察結果。

1.3.5 生物形容性的測定

根據GB 15979—2002《消毒技術規范》Technical standard for disinfection（2002年版） 進行急性經口毒性、皮膚刺激、陰道黏膜刺激、皮膚變態反應等試驗。

1.3.6 精制竹醋與中藥提取物復配作用評價

將厚樸、黃連提取物與精制竹醋按照2∶1，1.5∶1，1∶1，1∶1.5，1∶2進行配比，制備精制竹醋與中藥提取物不同配比的復配制劑，根據1.3.4進行殺菌作用測定。

（1）增效作用計算方法。①以所混化學藥劑為標準藥劑，則：

A的相對毒力指數：

所用標準藥劑的相對毒力指數：

TlI=100.

組合物M的理論毒力指數：

組合物M的實際毒力指數：

②增效作用的評判標準。一般認為共毒系數CTC＞120具增效作用，CTC=80～120為相加作用，CTC＜80為拮抗作用。共毒系數采用孫云沛方法計算，CTC=(ATI/TTI)×100。CTC＞120為增效作用，CTC=80～120為相加作用，CTC＜80為拮抗作用[7-9]。

2 結果與分析

2.1 2種竹醋液的理化性質

2種竹醋液理化性質對照見表1。

表1 2種竹醋液理化性質對照

竹醋液原液精制后能夠去除大部分竹焦油，精制后竹醋的折光率降低了5.9%，說明精制后去除了大量的大分子物質及雜質，可以更好地應用于食品加工領域。

2.2 2種竹醋液的抑菌及殺菌作用

2種竹醋液的抑菌效果比較見表2。

表2 2種竹醋液的抑菌效果比較

由表2可知，竹醋液原液對4種菌的抑制效果皆優于精制竹醋，并且2種竹醋液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果較為接近，這與常雅寧等人[10]通過竹醋液對食品污染菌的抗菌作用的研究結果相吻合。

2種竹醋液對供試菌的致死濃度見表3。

表2比較了竹醋液原液和精制竹醋對4種指示菌的致死濃度。由表3可知，質量分數為 25%及以上的竹醋液原液和精制竹醋可完全抑制4種受試菌的生長。此外，2種竹醋液對E.coli及S.aureus的最低殺菌質量分數均為5%，殺菌效果較為接近。而精制竹醋對P.aeruginosa的殺菌效果優于C.albicans，但對二者的最低殺菌質量分數均高于竹醋液原液。

表3 2種竹醋液對供試菌的致死濃度

2.3 中藥提取物的抑菌作用

中藥提取物的抑菌作用見表4。

表4 中藥提取物的抑菌作用

由表4可知，參照北京藥品檢驗所提供的常規抗生素藥敏抑菌圈標準，抑菌圈在21 mm以上，為抑菌能力強，以“+++”表示；在16～21 mm為抑菌能力較強，以“++”表示；15 mm以下為抑菌能力弱，以“+”表示；無抑菌圈出現為無抑菌作用，用“-”表示。中藥藥液的平均藥物質量濃度為7.5 mg/mL。由表3可知，厚樸及黃連對大腸桿菌的抑菌效果均優于其他中藥，同時，黃連對于白色念珠菌的抑制效果最佳。

2.4 混合劑的抑菌及增效作用

選擇厚樸和黃連、苦參、蛇床子、菖蒲、獨活浸提物與精制竹醋按照1∶1質量比輔配，厚樸和黃連、苦參、蛇床子與精制竹醋具有增效作用，其中厚樸和黃連與精制竹醋具有明顯增效作用，菖蒲、獨活與精制竹醋沒有增效作用。

不同混合制劑對4種菌的抑制作用見表5。

由表5可知，同一配比，黃連與精制竹醋混劑的增效作用均高于厚樸與精制竹醋混劑，并且C∶A=1.5～2∶1時效果最佳。

表5 不同混合制劑對4種菌的抑制作用

表6 受試物對小鼠急性經口毒性試驗結果

2.5 混合劑的生物相容性

2.5.1 急性經口毒性試驗

受試物對小鼠急性經口毒性試驗結果見表6。

混合制劑對小鼠的急性經口LD50大于5 000 mg/kg BW，根據消毒劑的急性評價規定，混合劑的急性經口毒性屬實際無毒級。

2.5.2 皮膚刺激試驗

受試物對家兔多次皮膚刺激性試驗結果見表7。

混合制劑對家兔多次皮膚刺激性試驗結果為無刺激性。

2.5.3 陰道黏膜刺激試驗

肉眼觀察染毒組和對照組各有2只家兔陰道黏膜可見輕微充血，染毒組有2只家兔陰道黏膜分別可見輕度和明顯的水腫，對照組未見水腫。病理檢查結果感染組的病例評分均值為7.33，對照組的評分均值為5.33，陰道黏膜刺激指數為0.33。

表7 受試物對家兔多次皮膚刺激性試驗結果

2.5.4 皮膚變態反應試驗

試驗組豚鼠在激發接觸混合劑后24，48 h均未見受試皮膚出現紅斑及水腫等刺激反應，皮膚致敏率為0；陽性對照組使用的陽性物為2.4-二硝基氯苯（致敏和激發質量濃度分別為10，8 mg/mL），致敏率為70%；陰性對照組豚鼠受試皮膚未見異常。結果表明，混合劑對豚鼠皮膚變態反應試驗結果為未見皮膚變態反應。

3 結論

竹醋液原液精制后抑菌及殺菌效果皆減弱，厚樸、黃連提取物對大腸桿菌及白色念球珠菌的抑菌效果優于連翹、牡丹皮、菖蒲及獨活提取物；厚樸和黃連、苦參、蛇床子與精制竹醋具有增效作用，菖蒲、獨活與精制竹醋沒有增效作用；黃連與精制竹醋混合制劑對4種菌的抑制效果最佳，并且此混合制劑屬于實際無毒級，對家兔皮膚進行多次刺激都表現為無刺激性，對豚鼠皮膚無致變態反應作用，但對家兔陰道黏膜有極輕刺激性，體現良好的生物相容性。