小鼠精子發生中環形RNA生成和功能分析

宋逸釩，倪 挺，魏 剛

(復旦大學 生命科學學院，上海 200438)

不孕不育日漸成為現代社會生殖健康面臨的嚴重問題，其中男性不育約占50%。從生物學的角度來看，男性生殖問題的關鍵是如何產生正常的生殖細胞，而精子發生又是生殖細胞產生的核心環節。深入研究并認知精子發生的分子機制，對人類的生殖健康、男性的生育調節、男性不育的診治均有十分重要的理論和實踐意義。臨床樣品上發現的與精子發生障礙相關的遺傳突變通常需要在小鼠等重要模式動物中進行功能驗證和機制探索，因此對于小鼠精子發生不同時期細胞的基因表達調控研究可為人類精子發生調節機制的闡明提供重要線索。除了信使RNA，新近研究還發現了不少lncRNA(long non-coding RNA，長非編碼RNA)在生殖細胞增殖、分化過程中起到重要作用[1]。環狀RNA(circular RNA,circRNA)作為lncRNA家族的一個新成員，其是否在精子發生過程中發揮特定的生物學功能也引起了廣泛的關注。

circRNA和過去研究的許多種類RNA不同，其序列并不以基因組外顯子正常的順序排列組成，而是RNA的5’末端和3’末端頭尾相連，形成一個像質粒一樣共價閉合的單鏈環狀分子[2]。按形成circRNA的序列在原始母基因中的類別，circRNA可分為外顯子、內含子和基因間區域來源，其中，目前發現的circRNA絕大多數來源于外顯子[2]。研究表明外顯子側翼的內含子中的反向重復序列(比如人中的Alu序列)可促進兩個線性外顯子的反向成環而形成circRNA[3]。

近年來的研究也不斷發現：circRNA具有多種基因調控功能，如高豐度的circRNA可以競爭所在母基因正常的剪接或可變剪接，從而使得正常剪接的RNA水平下降，引起下游的一系列反應[4]；circRNA可作為microRNA(miRNA)海綿吸附特定miRNA，繼而影響該miRNA對其下游靶基因的調控[5]。此外，circRNA上的m6A(腺嘌呤6位甲基化)修飾可以促進翻譯[6]。circRNA還可以通過結合RNA結合蛋白(RBP)[7]后與Pol II互作調控宿主基因的表達[8]等方式體現其功能。但是在精子發生過程中，circRNA的生成機制和下游功能尚不清楚。

精子發生是一個高度有序的過程，它的每一個階段都被精細調控。目前已知有一些RNA結合蛋白如ELAVL1/HuR、hnRNP G-T、NANOS2等在精子發生過程中起著重要調控作用[7,9-10]。同時，多種miRNA如miR-21[11]、miR-17-92簇[12]、mir-184[13]等也被證實在精子發生過程中起重要調節作用。有研究發現circRNA在睪丸中高度富集[14]，與合作者的研究也發現小鼠精子發生過程中lncRNA和circRNA均表現出了顯著的表達變化[15]，提示circRNA在精子發生過程中也可能起著重要作用，其上游的形成機制值得深入研究。利用之前發表的數據，系統分析了小鼠精子發生五個時期(小鼠精原干細胞、原始精原細胞、前細線期精母細胞，粗線期精母細胞及圓形精子細胞)中的circRNA及其可能成環機制，并分析探討了隨精子發生不同時期表達顯著變化的circRNA行使功能的可能機制。

1 材料和方法

1.1 數據獲取

所用數據來自于本實驗室之前發表的數據[15]，其生物學樣本均來自于DBA/2和C57BL6兩種品系的老鼠產生的雜交后代，樣本獲取、RNA提取及RNA文庫構建流程參見文獻[15]。原始數據也可從NCBI SRA數據庫下載(SRP067167)。每個時期樣品(處理)均有兩份生物學重復，各樣本及它們對應的原始reads數據見表1。為了讓后續分析更加精準，利用NGSQCToolkit[16]去除了原始測序數據中的低質量reads，并用fastuniq對質量過濾后的reads進行去冗余。

表1 參試樣本信息及測序reads數Table 1 Reference sample information and sequencing reads

1.2 小鼠精子發生過程中差異表達circRNA分析

CIRI[17]是一款常用的從RNA-seq測序數據中預測鑒定circRNA的軟件，使用CIRI的默認參數，預測各參試樣本中的circRNA，并將得到的circRNA和CIRCpedia數據庫[18]中的circRNA進行比對分析。采用sailfish-cir軟件[19](默認參數)對circRNA在各時期的表達進行定量分析。同時，借助sailfish_cir計算出的circRNA read數目，分析獲得到各個時期的環形-線性比。最后，為了確保circRNA差異表達分析的可靠性，僅對Ribozero文庫來源的circRNA使用Next maSigPro[20]分析五個時期中差異表達的circRNA，并采用R中的clusterProfiler包[21]對差異表達circRNA的來源基因進行了Gene Ontoloty(GO)功能類分析。

1.3 小鼠精子發生過程中circRNA上游生成機制分析

為了分析在小鼠精子發生過程中哪些因素可能影響了外顯子型circRNA的生成，首先分析了circRNA側翼內含子的長度，并將它和隨機抽取的內含子的長度進行比較。借助RepeatMasker[22]分析獲得基因組上重復序列，并歸類到幾種常見的反向重復序列類型；從它們在基因組中的位置信息判定哪些circRNA的側翼內含子含有反向重復序列，并計算每種重復序列在circRNA側翼內含子中的反向互補配對情況。

1.4 小鼠精子發生過程中circRNA功能機制預測

使用CIRI-FULL[23]和CIRI-AS[24]從基因組信息中獲取circRNA的序列信息。隨后用miRanda-3.3a預測circRNA中miRNA的結合位點(設置miRanda的參數為-sc 170 -en 25，相比較miRanda的默認參數-sc 140和-en 1，提升了score和energy閾值，減少了預測結果的假陽性)。結合circRNA序列信息和m6A基序(RRm5ACH)，利用IRESfinder[25]和自己編寫的程序搜索circRNA上的m6A潛在位點預測circRNA作為翻譯模板的可能性。結合POSTAR2數據庫[26]收集的RBP結合基序，搜索circRNA中潛在的RBP結合位點。

2 結果分析

2.1 小鼠精子發生5個時期中的環形RNA

利用CIRI2系統分析了小鼠精子發生各參試樣本的RNA-seq數據，共發現30 960個circRNA，其中有14 920個(48.2%)circRNA可被CIRCpedia數據庫中的circRNA交互驗證(見圖1a)。由于CIRCpedia數據庫中只收集了小鼠睪丸的circRNA，并未收集完整小鼠精子發生各個時期的所有數據[18]，因此推測余下的 circRNA(約50%)可能是小鼠精子發生特有的circRNA。RNaseR處理可以大量去除線性RNA從而富集circRNA，分析結果顯示，ribozero文庫來源的RNA-seq數據鑒定出的circRNA的數量在5個不同細胞類型中變化幅度不大；而在精原干細胞中，RNaseR處理文庫中發現的circRNA數要大大多于從ribozero文庫中發現的circRNA數目(見圖1b)，這也提示了CIRI發現circRNA的可靠性。

對精子發生各個時期的circRNA進行序列來源分析發現，它們絕大多數主要來源于外顯子區域，即外顯型circRNA(見圖1c)。由于circRNA可能通過競爭性剪接影響所在母基因的正常線性mRNA的生成，計算了各時期環形-線性比，發現十個樣本的環形線性比均小于3%(見圖1d)。但有趣的是，圓形精子細胞中環形線性比要明顯高于其他精子發生時期(見圖1d)。因為circRNA不易降解，所以推測圓形精子細胞中的circRNA增多更可能是circRNA上游生成機制的改變引起的。

2.2 精子發生過程中差異表達的circRNA及其所在基因的功能富集分析

分析小鼠精子發生不同時期circRNA本身的豐度差異和所屬母基因的功能情況可為circRNA在精子發生中的功能推測提供重要線索。判別差異表達的基礎是對circRNA豐度的定量，之前circRNA定量都是直接計算circRNA反向剪切連接處的讀長(Junction reads)數目，Li等開發了sailfish-cir軟件[19]，該軟件應用改進過的EM(Expectation-Maximization)算法對circRNA進行定量，能校正多種已知的系統性偏差，也克服了之前定量方法存在依賴測序深度、數據離散的缺陷，提高了circRNA定量的準確度。采用sailfish-cir算法對小鼠精子發生不同時期circRNA的穩態表達量進行了定量，隨后我們使用maSigPro基于線性回歸的方法分析了在不同時期樣本中表達量顯著不同(P≤0.001，軟件默認差異判斷標準)的circRNA，共得到409個差異表達circRNA。從這409個差異circRNA的熱圖中可以看出，circRNA表達量上升和下降的趨勢表現出了極高的一致性，并且組間差異較小(見圖2a)。為了探索這些差異表達的circRNA與小鼠精子發生過程的聯系，對這些circRNA來源的母基因做了基因本體(GO)富集分析，結果發現它們富集的生物學過程包括精子發生、纖毛運動和形態、微管束的形成和運動以及染色質修飾和組蛋白修飾等(見圖2b)，暗示相應circRNA可能在精子發生中起作用。上述結果暗示circRNA在精子發生過程中呈動態變化且所在基因與精子發生功能具有相關性。

圖1 小鼠精子發生各時期細胞中circRNA的數目、類型及環形線性比
Fig.1 Number,type,and circular-linear ratio of circRNA in mouse spermatogenesis

注：(b)中1和2指同一細胞類型的兩個生物學重復。RNaseR指對SSC細胞進行RNaseR酶處理去除線性RNA的樣品。(c)中外顯子來源即exon、內含子來源即intron、基因間區域即intergenic。

圖2 小鼠精子發生不同時期circRNA的差異表達及所在基因功能富集分析Fig.2 Differential expression of circRNA and functional enrichment analysis of the gene in mouse spermatogenesis at different stages

2.3 小鼠精子發生中circRNA的上游生成機制分析

已有研究表明，在人細胞中側翼內含子中反向重復序列的配對可促進外顯子來源的circRNA的生成，外顯子型circRNA的兩個側翼內含子中Alu重復序列的反向配對(Inverted repeated across，即IRacross)數目與同一內含子內部的Alu序列的配對(Inverted repeated within，即IRwithin)數目之間的競爭是circRNA形成的重要因素(見圖3)，IRacross配對數目越大，越能促進circRNA的生成[3]。

圖3 circRNA形成及側翼內含子中重復序列反向互補配對示意圖Fig.3 CircRNA formation and reverse complementary repeated sequences in flanking introns

注：一個circRNA由綠色和藍色兩個exon組成，位于兩個側翼內含子中的重復序列反向互補配對(IRacross)可以促進circRNA的生成，而位于同一內含子中的重復序列反向互補配對(IRwithin)則會抑制circRNA的生成。

小鼠中除了SINE/Alu序列，還有SINE序列(SINE/B2和SINE/B4)、LINE/L1、ERVL-MaLR和ERVK等內源逆轉錄病毒來源的重復序列。那么小鼠精子發生過程中這些不同類型的重復序列間的互補配對是否也對circRNA的形成有貢獻呢？為了回答這個問題，對小鼠精子發生中外顯子來源的circRNA的側翼內含子進行了系統分析。首先將circRNA側翼內含子的長度和隨機抽取的內含子進行了比較，結果發現，小鼠精子發生相關細胞中所存在的circRNA的側翼內含子的長度明顯比隨機抽取的內含子更長(見圖4a)(Wilcoxon Signed Rank Test，P<0.001)。接著評估外顯子來源的circRNA兩個側翼的內含子之間所形成的反向互補配對的數目，結果顯示，小鼠精子發生過程中circRNA側翼內含子中各種類型的IRacross數目均顯著多于隨機獲取的內含子中的IRacross數目(見圖4b)，提示小鼠精子細胞中多種重復序列對circRNA的形成均有潛在貢獻。比較了circRNA的側翼內含子和隨機抽取的內含子中IRacross-IRwithin差值，發現成環的外顯子中該值也顯著大于對照(見圖4c)，進一步提示側翼內含子中反向重復序列的配對可能是小鼠精子發生過程中細胞內circRNA生成的重要促進因素。

2.4 circRNA下游功能預測

在小鼠精子發生過程中發現了許多circRNA，這些circRNA在精子發生進程中的潛在生物學功能是值得探討的問題。circRNA可以通過多種方式來發揮其生物學功能，如促進所在基因的轉錄、競爭所在基因成熟mRNA的產生、作為microRNA(miRNA)的分子海綿、作為多個蛋白質結合的分子海綿、作為翻譯模板等[5-6]。主要從兩個層面來分析這些circRNA潛在的功能，即作為miRNA分子海綿的circRNA和具有翻譯潛能的circRNA，同時對circRNA和RBP的互作進行了初步分析。

2.4.1 circRNA與miRNA結合作為miRNA“海綿”的功能預測

精子發生中miRNA可通過轉錄后調控調節其靶基因的表達進而影響精子發生進程，如miR-19a、miR-19b通過調節PTEN的表達來影響原始生殖細胞的增殖[27-28]， miR-122a通過結合TNP2對精子生成的后期階段發揮調控作用[29]等。那么研究發現的409個精子發生中差異表達的circRNA中有多少可能通過miRNA分子海綿的方式起作用呢？利用miRanda-3.3a[30]對這409個差異表達的circRNA進行了miRNA結合位點預測，結果發現137個circRNA具有miRNA結合位點，涉及124個miRNA。值得提及的是，研究發現具有miRNA結合位點的circRNA中都只有一個miRNA結合位點(見圖5a)。雖然早期的研究曾報導circRNA可結合很多的miRNA，但研究表明，只有一個miRNA結合位點的circRNA也可調控相應miRNA的效應濃度并對表型產生影響[31]。發現MMU_CIRCpedia_39694(chr4:45987462|45990230)這個circRNA來源于精子發生相關基因TDRD7，預測分析發現它可以結合mmu-miR-7042-5p，從而有可能減少該miRNA對有功能的TDRD7線性mRNA的影響。精子發生過程中這些潛在的circRNA-miRNA互作在小鼠精子發生中的調控作用有待后續實驗進一步驗證。

圖4 circRNA側翼內含子長度及其中的反向互補配對的重復序列分析Fig.4 Length of circRNA flanking introns and repeated sequence analysis of their reverse complemen tary pairs

2.4.2 circRNA上的m6A基序促進翻譯的功能預測

有研究表明，一些circRNA可作為翻譯模板產生蛋白質，這些可被翻譯的circRNA具有m6A修飾和特定的基序(RRm5ACH)，這一特征可招募翻譯起始復合物并促進核糖體組裝，使circRNA最終可以翻譯出蛋白質[6]。為了考察精子發生過程中是否存在具有潛在翻譯功能的circRNA，以普通的mRNA序列作為對照組，對全體circRNA、差異表達的circRNA和來自精子發生相關基因的差異表達circRNA分別進行m6A基序預測分析，發現全體circRNA中有85%的序列含有RRm5ACH基序，而作為對照的全部mRNA的序列中該基序的比例僅為69%，兩者間存在顯著差異(見圖5b左，p值 < 0.001，Wilcoxon Signed Rank Test)。而使用IRESfinder[25]發現所有circRNA中有46%的序列含有IRES(Internal ribosome entry site，內部核糖體進入位點)位點，而作為對照的全部mRNA的序列中僅有32%，兩者間亦存在顯著差異(見圖5b右，p值 < 0.001，Wilcoxon Signed Rank Test)。這一結果暗示精子發生過程中的部分circRNA有潛在的蛋白編碼功能。對相應circRNA進行更為深入的實驗和功能驗證或許有可能為深入理解精子發生的分子調控機制開辟新的視角。

2.4.3 circRNA與RNA結合蛋白(RBP)的互作分析

circRNA可與RBP結合從而影響特定的生物過程。Du等發現circ-FOXO3與CDK2蛋白結合可抑制細胞周期進程[32]，Abdelmohsen等發現circ-PABPN1可競爭性結合HuR并進而抑制HuR與PABPN1的mRNA結合，從而降低PABPN1翻譯效率[33]。NF90/NF110能和成熟的circRNA直接結合形成circRNA-蛋白復合體(circRNP)，并在抗病毒過程中發揮重要的免疫功能[34]。小鼠精子發生過程中的circRNA是否也有結合RBP的潛力？為了回答這個問題，利用公共數據庫中的RBP數據庫POSTAR2對精子發生過程中的circRNA進行了系統分析。結果發現，共有10 517個circRNA具有RBP結合位點，其中除了約3 547個circRNA只有1個RBP結合位點外，其余circRNA都有2個以上的潛在RBP結合位點(見圖5c)，甚至部分circRNA有10個以上的潛在RBP結合位點(見圖5c)，如chr19:5800494|5800738含有31個，chr17:39845133|39845215含有30個。另外，除了一個circRNA可以結合多個RBP，一個RBP也可能被多個circRNA所吸附。比如我們發現總共有558個circRNA含有MSI2蛋白結合位點，而MSI2蛋白被報導在精子發生過程中起重要作用[35]。上述結果強烈暗示，circRNA可能通過“RBP海綿”的作用來調節細胞中相應RBP的效應濃度。circRNA-RBP互作在精子發生中的作用很值得后續深入研究。

圖5 小鼠精子發生相關細胞中circRNA的m6A基序及miRNA、RBP結合位點分析Fig.5 Analysis of m6

3 討 論

circRNA是一種特殊形式的內源性RNA，其閉環結構使之可能逃脫細胞內核酸外切酶的作用，并可能通過多種方式發揮其生物學功能。circRNA的上游生成機制雖已在人類細胞中進行了分析和部分功能證明，但小鼠精子發生過程中大量產生的circRNA是否通過類似的機制生成仍不清楚。通過系統的生物信息學分析發現各種類型的反向重復序列(SINE/L1、SINE/B2、SINE/B4、ERVL-MaLR和ERVK)在小鼠精子發生過程中產生的circRNA側翼內含子中均有富集(見圖4b、4c)，提示它們也可能具有類似人circRNA側翼內含子中Alu序列促進circRNA生成的功能。本研究結果拓展了外顯子型circRNA生成機制的順式作用元件類別，為理解circRNA生成的分子調控機制提供了新的線索，但具體的作用機制還需進一步的實驗驗證(如在circRNA表達載體中引入這些不同類別的重復序列)。

目前尚未有circRNA在小鼠精子發生中起作用的報道。雖然我們發現了精子發生過程中有大量的circRNA產生，并初步推測了其形成機制，但它們中哪些circRNA對精子發生有調控作用，以何種方式起作用仍不清楚。功能驗證需要尋找有潛能的候選circRNA，而本研究預測分析發現的部分circRNA的miRNA海綿功能、翻譯模板潛能預測和RBP分子海綿等可為篩選功能性circRNA提供有價值的參考線索。雖然生信分析不能直接證明這些circRNA在精子發生中的作用，但其分析結果暗示部分circRNA有可能通過多種方式來參與精子發生的調節，后續的研究可在此基礎上篩選候選circRNA，通過設計反向引物并結合定量PCR(qRT-PCR)驗證相應circRNA的存在，繼而構建circRNA過表達載體并注射小鼠睪丸，使得相應細胞中過表達該circRNA；或者在小鼠中通過基因編輯刪除配對的反向重復序列來下調circRNA的產生，從而驗證其是否具有調控精子發生表型的功能。