SHCBP1：乳腺癌治療候選靶點和潛在預后標志物

趙詩哲，徐佳寶，毛金校

(1.重慶醫科大學 附屬兒童醫院藥學部；兒童發育疾病研究教育部重點實驗室；國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心；兒童發育重大疾病國家國際科技合作基地；兒科學重慶市重點實驗室，重慶市 400010；2.河南大學 基礎醫學院病理學教研室，河南 開封 475004)

乳腺癌是全球范圍內最常見的腫瘤之一[1]，在女性腫瘤患者中，乳腺癌致死率排名第二[2]。如今，乳腺癌的治療包括局部手術、全身化療、精確放療、內分泌治療、生物靶向制劑治療等手段，而生物標志物可用于建立病人預后和預測的結果。因此，尋找更有效、靈敏的乳腺癌預后生物標志物是乳腺癌研究的迫切需要[3]。過去的幾十年，新型治療靶點的發現和新型靶向藥物的開發已大大改變了抗乳腺癌戰場的局面[4-5]。

Src homology 2 domain containing(Shc)家族包含ShcA、ShcB，ShcC和ShcD4個亞基因家族[6]，SHC SH2-domain binding protein 1(SHCBP1)在酵母雙雜交實驗中首次被鑒定出來，目的是尋找適配蛋白ShcA新的結合伴侶[7]。因為SHCBP1在T細胞活化時表達上調，所以它最初被命名為鼠活化淋巴細胞蛋白(mPAL)[7]。

SHCBP1可以通過其他途徑來影響多種惡性腫瘤如肝癌、神經膠質瘤、滑膜肉瘤等的生長[8-9]。有研究表明，SHCBP1在乳腺癌細胞中過度表達[10]。但目前對于SHCBP1的表達與預后作用方面的關系研究匱乏。利用多種常用公共數據庫中乳腺癌臨床數據，評估分析了SHCBP1在不同亞型乳腺癌中的表達水平和潛在的臨床價值，以期為SHCBP1靶向治療的未來發展和乳腺癌的預后和預測提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 Oncomine分析

Oncomine數據庫是一個可公開訪問的在線癌癥表達譜數據庫(www.oncomine.org)。在數據庫中，通過查詢SHCBP1，通過選擇乳腺癌與正常組織進行比較。在本次研究中，P值由studentt檢驗產生，用于乳腺癌和正常組織中SHCBP1 mRNA水平的比較。有效倍數變化閾值定義為2，P值設置為0.01[11]。

1.2 bc-GenExMiner v4.2分析

bc-GenExMinerv4.2(bcgenex.centregauducheau.fr/BC-GEM/)在2019年1月進行數據更新，是一種數據挖掘工具，包含36個已發表的注釋基因組數據[12-13]。根據臨床標準(如激素受體、淋巴結狀態等)，用三個模塊來呈現統計的數據，使用表達模塊分析SHCBP1基因的臨床參數，如Scarff Bloom&Richardson分級(SBR)、諾丁漢預后指數(Nottingham Prognositc Index,NPI)、雌激素受體(ER)、孕酮受體(PR)、表皮生長因子受體-2 (HER-2)、基底細胞樣(Basal-like)；使用預后模塊評估SHCBP1表達模塊與轉移復發事件的相關性；使用相關模塊評估SHCBP1與CDC45的相關性。

1.3 Kaplan-Meier plotter分析

Kaplan-Meier plotter(www.kmplot.com)是一個微陣列數據集的在線數據庫，數據來源于GEO,EGA和 TCGA三個數據庫。使用Kaplan-Meier plotter評價無轉移生存期(R)和無復發生存率(RFS)，顯著性利用log-rankP值表示[14]。

1.4 STRING分析

STRING(http://string-db.org/)是一個可用于確定蛋白質與蛋白質的相互作用的在線數據庫[15]。本文通過該數據庫對SHCBP1進行蛋白質網絡分析，以發現可能與SHCBP1存在相互作用的蛋白質。

2 結果分析

2.1 與正常乳腺組織相比，SHCBP1在乳腺癌中顯著高表達

大量研究表明，SHCBP1在多種癌癥中高表達，如白血病、肝細胞癌等[8]。而Oncomine分析結果也證實了該表型(見圖1a)。與正常組織相比，SHCBP1在乳腺癌組織中高表達。在乳腺癌中，有6組數據顯示乳腺癌組織高表達SHCBP1，而僅有1組數據顯示正常組織內SHCBP1高表達。癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數據和Richardson研究表明，幾種類型的乳腺癌中SHCBP1轉錄水平均高于正常組織(見圖1b～1g)。

圖1 SHCBP1在乳腺癌組織中的表達明顯高于正常組織Fig.1 The expression of SHCBP 1 in breast cancer tissue is significantly higher than that in normal tissue

注：(a)圖顯示了具有統計學意義的mRNA過度表達(紅色)或靶基因的下調表達(藍色)的數據集的數目。P值閾值為0.01。每個方框中的數字代表在這些分析和癌癥類型中達到閾值的分析數量。在每一項研究中，以所有基因中所測得的目標基因的百分比來分析基因等級。分析結果顏色由方框內分析的最佳基因等級百分位數決定。(b-g)TCGA數據庫(b-f)，(g)中SHCBP1 mRNA表達的比較。利用Oncomine數據庫比較SHCBP1在正常組織和乳腺癌組織中的表達得出箱式圖。P值設為0.01，有效倍數變化閾值定義為2。

表1 SHCBP1 mRNA表達與乳腺癌臨床特征參數的關系Table 1 Relationship between SHCBP1 mRNA expression and clinical characteristic parameters of breast cancer

注：“-”：無顯著差別；“↑”：轉錄水平增高；“↓”：轉錄水平下降；No:每組所含的樣本數目。

2.2 SHCBP1在不同分子亞型的乳腺癌患者中的表達不同

如表1所示，使用bc-GenExminer v4.2進行Welch試驗，根據不同的臨床病理特征，比較各組患者SHCBP1的轉錄水平。結果表明，≤51歲組與>51歲組間無顯著性差異(P=0.975)。淋巴結陽性(Nodal status+)的乳腺癌患者中SHCBP1 mRNA水平與淋巴結陰性者(Nodal status-)相比無顯著差異(P=0.053)。ER(+)(P=0.000)、PR(+)(P=0.000)與SHCBP1 mRNA表達呈負相關 (見表1)。相反，與HER2(-)患者相比，SHCBP1 mRNA水平在HER2(+)患者中表達較高(P=0.000)(見表1)。組間比較還表明，在三陰性乳腺癌(TNBC)中，SHCBP1 mRNA表達顯著高于非TNBC(P=0.000) ，而在Basal-like亞型中SHCBP1 mRNA表達顯著高于其他亞型(P=0.000)(見表1)。在分子亞型分析中，SHCBP1在HER-2亞型和Basal-like亞型中的表達明顯高于乳腺癌的Luminal A亞型和luminal B亞型(Dunnett-Tukey-Kramer’s test，P=0.000)(見圖2a)。而在諾丁漢預后指數(NPI) 分析中，NPI水平越高，SHCBP1的mRNA表達越高(P=0.000)(見圖2b)。在Scarff Bloom&Richardson分級標準(SBR)中，SBR分級越高，SHCBP1 mRNA水平越高(P=0.000)(見圖2c)。

圖2 SHCBP1在不同分子亞型乳腺癌患者中的表達Fig. 2 SHCBP1 expression in breast cancer patients with different molecular subtypes

2.3 SHCBP1的表達與乳腺癌患者的無轉移生存期(DMFS)預測

SHCBP1的表達增高可以預測乳腺癌患者的無轉移生存期(DMFS)較短，尤其是Luminal A亞型的乳腺癌患者中評估了SHCBP1對乳腺癌遠處轉移的預后價值。Kaplan-Meier plotter分析表明，在乳腺癌患者中，SHCBP1 mRNA的高表達與DMFS的縮短有關(HR=1.85,P=0.000)(見圖3a)，尤其是在Luminal A亞型乳腺癌患者中(HR=1.96,P=0.000)(見圖3b)時。然而，在Luminal B亞型乳腺癌患者(HR= 1.06,P=0.75) (見圖3c)，HER-2(+)亞型乳腺癌患者(HR=1.28,P=0.44) (見圖3d)或Basal-like亞型乳腺癌患者(HR=0.9,P=0.69) (見圖3e)中，SHCBP1 mRNA的高表達或低表達與DMFS的縮短無顯著差異。

圖3 高表達SHCBP1的乳腺癌患者具有較短的DMFS，尤其是Luminal A亞型乳腺癌患者Fig.3 Breast cancer patients with high SHCBP1 >expression have shorter DMFS,especially those with Luminal A subtype breast cancer

Kaplan-Meier plotter分析表明:所有類型乳腺癌患者SHCBP1 mRNA的表達與DMFS相關;Luminal A亞型乳腺癌患者1 mRNA表達與DMFS相關;SHCBP1 mRNA表達與Luminal B亞型乳腺癌患者的DMFS沒有相關性;SHCBP1 mRNA表達與HER-2亞型乳腺癌患者的DMFS沒有相關性;SHCBP1 mRNA表達與Basal-like亞型乳腺癌患者的DMFS沒有相關性。

2.4 SHCBP1表達高的Luminal A亞型乳腺癌患者具有較短的無病生存期(DFS)

為進一步探究SHCBP1在不同亞型乳腺癌中的預后情況，對GSE41994數據集[16]中的Luminal A亞型病人臨床數據展開分析，發現SHCBP1高表達的乳腺癌患者具有較差的DFS(HR=2.93,P=0.002)(見圖4a)，而在Luminal B亞型中，SHCBP1的表達與DFS的長短無關(HR=1.32,P=0.786)(見圖4b)。由于HER-2(+)亞型，Basal-like亞型乳腺癌數據庫樣本數量不足，因此無法分析SHCBP1的表達對這兩類亞型的乳腺癌DFS的影響。

圖4 高表達SHCBP1的Luminal A亞型乳腺癌患者具有較短的無病生存期(DFS)Fig.4 Patients with Luminal A subtype of breast cancer with high expression of SHCBP1 have a short DF

2.5 SHCBP1的表達升高可表現出更短的無復發生存率(RFS)

SHCBP1的表達升高可表現出更短的無復發生存率(RFS),尤其是在ER(+)、PR(+)、僅接受輔助化療,和僅接受輔助化療治療的ER(+)與接受包括或排除內分泌治療乳腺癌患者中，且SHCBP1的高表達與較高的轉移復發風險相關。所有的乳腺癌患者的SHCBP1 mRNA高表達與RFS縮短顯著相關(HR=1.76,P=0.000)(見圖5a)，特別是在ER(+)亞型(HR=1.52,P=0.000)(見圖5b)和PR(+)亞型(HR=1.74,P=0.002)(見圖5c)的乳腺癌患者中。值得注意的是，對接受不同治療的乳腺癌患者，SHCBP1 mRNA的高表達與僅接受輔助化療的患者的RFS縮短顯著相關(HR=2.15,P=0.000)(見圖5d)。在ER(+)亞型中具有顯著相關性(HR=2.13,P=0.003)(見圖5e)，而在ER(-)亞型中無顯著相關性(HR=1.3,P=0.23)(數據未展示)。這些結果表明SHCBP1對乳腺癌耐藥性起關鍵的作用，可能與ER的表達有關。在接受內分泌治療(HR=1.4,P=0.007)(見圖5f)或無內分泌治療(HR=1.74,P=0.000)(見圖5g)的乳腺癌患者中，SHCBP1 mRNA的高表達與RFS的縮短顯著相關。在僅接受他莫昔芬治療的乳腺癌患者中，這種相關性并不顯著(HR=1.23,P=0.16)(數據未顯示)。

圖5 Kaplan-Meier plotter分析表明SHCBP高表達的乳腺癌患者生存率低Fig.5 Low survival rate of breast cancer patients with high SHCBP1 expression indicated by Kaplan-Meier plotter

2.6 SHCBP1和CDC45 mRNA之間呈正相關

Oncomine分析SHCBP1的共表達基因，發現CDC45與SHCBP1顯著正相關(見圖6a)。研究發現，人類腫瘤來源細胞的CDC45蛋白水平始終較高，CDC45的表達與增殖細胞群密切相關[17]。利用bc-GenExMiner v4.2數據挖掘，證實了SHCBP1和CDC45 mRNA之間的確實存在正相關性(見圖6b)。

2.7 SHCBP1蛋白質相互作用網絡分析

僅僅通過共表達分析并不能完全揭示出SHCBP1作用于乳腺癌的機制。因此，通過STRING對SHCBP1進行蛋白質相互作用網絡分析，獲得了潛在的與SHCBP1作用的10個蛋白質：KIF23、NCAPG、CCNA2、CDCA8、KIF20A、RACGAP1、CDK1、SHC1、BUB1B、TPX2。除SHC1外，其余蛋白質均與細胞分裂密切相關。根據STRING分析，KIF23與SHCBP1具有最強的相互作用關系(Score=0.958)(見圖7)。

圖6 SHCBP1和CDC45的表達呈正相關Fig.6 Positive correlated of the expression of SHCBP1 and CDC45

圖7 SHCBP1的蛋白質相互作用網絡Fig.7 Protein-protein interaction netaork of SHCBP1

3 討 論

Shc基因家族在哺乳動物細胞凋亡和耐藥性調控中具有重要作用[18]，SHCBP1是ShcA的結合伴侶基因。一個好的藥物靶點應該具有高度特異性和對正常細胞毒性小的特點。通過慢病毒介導SHCBP1基因的敲除實驗，Western blot檢測顯示，sgRNA感染乳腺癌細胞中SHCBP1蛋白表達明顯降低，sgRNA慢病毒敲除SHCBP1顯著抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖，表明SHCBP1可能成為乳腺癌治療的有效靶點[10]。

根據圖2a所示， Luminal B亞型乳腺癌患者中SHCBP1 mRNA高表達，但Kaplan-Meier plotter及GSE41994數據集分析表明SHCBP1 mRNA表達與Luminal B亞型乳腺癌患者的DMFS,DFS沒有相關性，這里存在兩種可能：(1)SHCBP1在Luminal B亞型患者總體表達水平較高所以不能作為Luminal B亞型的預后標志物；(2) Luminal B亞型本身預后較差，因其低預后使得DMFS按SHCBP1區分不明顯。根據臨床研究，Luminal B亞型較Luminal A亞型具有更差的預后，但這是由于Luminal B型乳腺癌具有更多的不良預后因素，在腫瘤分期、組織分級及腫瘤大小等基線特征基本一致的情況下，Luminal A亞型與Luminal B亞型乳腺癌對預后的影響沒有差異[19]，Luminal B亞型并不能作為獨立的預后因素。因此，SHCBP1是由于在Luminal B亞型患者總體表達水平較高所以不能作為Luminal B亞型的預后標志物。

通過分析多種公共數據庫中的數據集，發現與其他輔助因素協同作用導致腫瘤發生的基礎。這樣的規律在臨床對乳腺癌的診治中具有極大的價值。在確定患者的腫瘤亞型后，可以通過此規律來大致推測患者的預后。如患者的腫瘤是ER(-)或PR(-)亞型，就需要醫護人員更頻繁的平時監護以及術后監護，更密切地觀察患者情況，一旦出現預后不良的征兆，及時發現并處理，以提升患者的存活率，延長存活時間。而在對各種亞型的乳腺癌患者的預后分析中，如果為Luminal A亞型，SHCBP1 mRNA高表達與DMFS(HR=1.96,P=0.000),DFS(HR=2.93,P=0.002)的縮短有關。所以對于結束住院治療的乳腺癌患者，應定期復查，檢驗醫師可通過SHCBP1的表達量來推斷Luminal A亞型乳腺癌患者的預后情況，這對于改善乳腺癌患者的預后有很大的價值。

通過共表達相關分析發現，在乳腺癌中，SHCBP1可能與CDC45信號通路密切相關。有研究發現CDC45在DNA復制的起始和延長過程中起關鍵作用[20-21]，而CDC45在長期靜止或衰老的細胞中沉默，但在不同組織來源的人癌細胞株中過度表達[17]。這提示SHCBP1可能通過調控CDC45表達來參與腫瘤的遷移和侵襲，但此前從未有過文獻表明CDC45與乳腺癌之間有關聯。因此，這非常有必要通過生物化學和分子生物學手段探究SHCBP1是否與CDC45作用共同參與乳腺癌發生發展過程。

STRING相互作用網絡分析進一步揭示了SHCBP1參與乳腺癌發生發展的機制：通過調節一些與細胞分裂關系密切的蛋白質，來調控乳腺癌細胞的分裂。分析表明，蛋白質KIF23與SHCBP1相互作用關系最強，而已知研究證明KIF23 mRNA高表達與ER(-)乳腺癌患者的不良預后具有極強的相關性[22]；NCAPG可作為ER(+)乳腺癌的預后標志物[23]；CCNA2可作為ER(+)乳腺癌的預后標志物，其高表達與ER(+)乳腺癌的較差預后以及他莫昔芬抗性相關[24]。據圖7所示，以上三個基因都與SHCBP1的表達具有極高的相互作用關系。

利用多種數據庫進行數據挖掘，發現與正常組織相比，SHCBP1在乳腺癌組織中表達較高，且該基因高表達的Luminal A亞型乳腺癌患者預后較差。此外，通過共表達分析及蛋白質分析，初步探究SHCBP1作用于乳腺癌的潛在機制。這些證據均表明SHCBP1是一種很有前景的乳腺癌預后指標及潛在治療靶點。

4 結 論

1)SHCBP1的表達量可用于預測Luminal A亞型乳腺癌患者的預后情況。

2)SHCBP1可作為乳腺癌潛在的治療靶點。

3)SHCBP1和CDC45 mRNA表達水平之間呈正相關，并可能通過與KIF23等10種蛋白相互作用來參與乳腺癌發生發展。