萘乙酸對綠豆芽維生素C的影響及其殘留量的研究

陳功軒，王 杏，張洪權，鄧櫻花*

(1.湖北第二師范學院化學與生命科學學院，武漢 430205；2.湖北第二師范學院植物抗癌活性物質提純與應用湖北省重點實驗室，武漢 430205)

綠豆芽含有豐富的營養成分，例如維生素C、B、A、E及多種礦質元素，其中維生素B17是較強的抗癌物質，經常食用芽菜能有效防治高血壓、糖尿病、高膽固醇、胃癌及直腸癌等多種疾病[1-2].綠豆芽因營養價值高，為廣大消費者所喜愛，市場需求量極大.

研究表明，萘乙酸(NAA)是一種廣譜型植物生長外源性調節劑，機理上NAA能顯著促進內源性生長素生成及代謝[3-4].生長素參與植物生長發育的各個階段，它們可能在極低的濃度條件下調節細胞的伸長、分裂，組織腫脹，不定根的形成，胚胎發生的誘導以及促進細胞壁的松弛等[5].因此在農業生產中，為加快種子發芽，植株生長，有人將NAA應用于種子萌發和生長的各個階段.但是NAA對人畜是有低毒性的，大鼠急性口服LD50為1 000～5 900 mg·kg-1，對皮膚和粘膜有刺激作用.因此從食品安全的角度看，尋找一種靈敏度高、專一性強、操作簡便的定性定量分析NAA殘留的方法具有重要意義.

目前，NAA的分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[6]、液相—質譜聯用法[7]、氣相色譜法[8]、氣相—質譜聯用法[9]等多種方法.高效液相色譜法具有專一性強、靈敏度高、重現性好和操作簡便等優勢，被廣泛應用于NAA的測定[10-12].

本文以市場上出售的普通綠豆為試材，發芽后測定不同濃度NAA處理下的胚根、下胚軸和子葉等部位維生素C含量，初步探討不同濃度NAA對綠豆芽維生素C的影響，旨在為綠豆芽生產選擇最適濃度的生長調節劑提供一定的參考價值.此外，采用高效液相色譜法，對綠豆芽中NAA的殘留做進一步分析測定.

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

萘乙酸(NAA)、磷酸、可溶性淀粉、碘酸鉀、碘化鉀、氫氧化鈉等均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；甲醇(HPLC級)購自Tedia (Tedia Chemical,USA).

Agilent1260高效液相色譜儀(配四元泵、在線脫氣和紫外檢測器)、BD-FYX種子發芽箱(南京貝蒂實驗儀器有限公司)、SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)、BUCHI旋轉蒸發儀R-210(瑞士步琦有限公司)、Eppendorf高速離心機5840R(恒科貿易)、ME104E 電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)和FE28 pH計(梅特勒-托利多有限公司).實驗中所用水為超純水(Millipore,Bedford,MA,USA).

NAA培養液的配制：準確稱量一定量NAA，用少量酒精溶解，再用超純水配制濃度為1×10-5mol·L-1的NAA培養液，再逐步稀釋成1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol·L-1的NAA培養液，共5個濃度.

NAA標準工作液的配制：稱取NAA 適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成250 μg·mL-1的儲備液；然后將儲備液稀釋成為0.50～30.00 μg·mL-1的NAA標準工作液系列，低溫避光保存.

1.2 實驗方法

1.2.1 發芽試驗 挑選外表無殘缺、健康、發芽勢好、發芽率高的200粒新鮮綠豆六組.取6個培養皿編號1、2、3、4、5、6，用酒精擦拭消毒，1到5號培養皿分別依次加入10 mL的1.9 μg·mL-1、1.9×10-1μg·mL-1、1.9×10-2μg·mL-1、1.9×10-3μg·mL-1、1.9×10-4μg·mL-1NAA 培養液和200粒綠豆，6號培養皿中加入10 mL超純水和200粒綠豆作為對照.放入種子發芽箱內培養，溫度設為25 ℃，無光照.每天9∶00、14∶00、19∶00分別在6個培養皿中定時澆自來水30 mL.

1.2.2 維生素C(Vc)含量的分析(碘量法) 樣品提取：在培養的第7 d，將用NAA溶液處理過并發芽且長勢一致、性狀穩定的綠豆芽依次按從小到大的濃度選取足夠量作為實驗材料.然后用天平稱取0.5 g綠豆芽的子葉各三份放入研缽中，充分研磨勻漿，分別移取2%的鹽酸4 mL沖洗研缽加入10 mL離心管中，搖勻，放入離心機離心轉速為4 000 r·min-1，溫度為4 ℃，時間15 min，取上清液為提取液[13].

滴定：在三角瓶中，用移液管中注入1% KI液0.50 mL、0.5% 淀粉液1.00 mL、樣品提取液5.00 mL、蒸餾水3.50 mL.用0.000 167 mol·L-1碘酸鉀滴定，緩慢加入并搖動三角瓶.至溶液顏色為微藍色，半分鐘不褪色.記錄消耗碘酸鉀的毫升數.另空白對照組加入1% KI液0.50 mL、0.5% 淀粉液1.00 mL、2% 鹽酸5.00 mL、蒸餾水3.50 mL[14].

以相同方法測量綠豆芽下胚軸、胚根中Vc含量.

1.2.3 色譜分析方法

1) 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18反相色譜柱(4.6×150 mm,5 μm);流動相：A為甲醇、B為磷酸-氫氧化鈉緩沖溶液(0.01 mol·L-1，pH=3.0);流動相比例A%∶B%=70∶30，等度洗脫;柱溫：40 ℃;檢測波長為220 nm;流速1.0 mL·min-1;進樣量20 μL.

2) 樣品處理

參考文獻[15]的樣品處理方法,在培養的第8天，選取培養的長勢正常、性狀完整的豆芽，純水潤洗三次再用濾紙吸干,準確稱取20.0 g,切碎后將樣品研磨成勻漿,加入60 mL預冷(-20 ℃)的80%甲醇溶液，勻漿液在常溫下(不超過25 ℃)超聲震蕩30 min，然后在4 ℃、4 000 r·min-1的條件下離心15 min.抽濾，將濾液轉至旋蒸瓶內，減壓蒸發濃縮至約10 mL水溶液.

將減壓濃縮后的水溶液用2.0 mol·L-1HCl調pH至2.5～2.9，溶液轉入250 mL的分液漏斗，加入相同體積的乙酸乙酯萃取2～3次.NAA在此條件下完全溶于乙酸乙酯溶液中.合并上層乙酸乙酯相，并在旋轉蒸發儀上減壓蒸發(38 ℃)至干，用純甲醇溶解后定容至10 mL進行HPLC分析.

2 結果與討論

2.1 不同濃度NAA對綠豆芽Vc含量的影響

用碘量法對綠豆芽胚根、下胚軸、子葉等部位所含VC的量進行測量，對比施加NAA培養液和空白組，分析NAA對綠豆芽品質的影響.測量結果見表1.

表1 綠豆芽中各部位Vc含量Tab.1 Vc content in different parts of mungbean sprouts

由表1可知，在培養綠豆芽過程中，不同濃度的NAA培養液對豆芽品質有一定的影響.從下胚軸來看，當NAA濃度為1.9×10-1μg·mL-1時，Vc含量為NAA空白培養液的2倍以上(p<0.05).從子葉來看，當NAA濃度為1.9 μg·mL-1、1.9×10-1μg·mL-1時Vc含量均較高，其含量為空白的2.5至3 倍左右(p<0.05).綜合比較，認為采用較低濃度而非高濃度NAA培養液，如1.9×10-1μg·mL-1，即能促進綠豆發芽成根，及提升綠豆芽中Vc含量，這與文獻[16-17]吻合.

2.2 NAA分析色譜條件的建立

2.2.1 最大吸收波長的確定 在190～400 nm紫外波長范圍內對NAA的標準溶液進行掃描，如圖1所示.從圖中可見，NAA的最大吸收波長為220 nm.后續NAA殘留分析中，紫外檢測波長選擇在220 nm.

2.2.2 流動相的選擇 分別采用45%、55%、65%、70%、75%含量的甲醇作為流動相，考察其對NAA保留時間的影響.當甲醇含量為45% 的時候，NAA保留時間為13.22 min，如圖2所示，時間較長.隨著甲醇含量提高，NAA保留時間變短，當甲醇含量為70%的時候，NAA保留時間2.76 min，時間較短，如圖3所示.當甲醇含量繼續提高到75%時，NAA與雜質峰沒有達到基線分離.因此實驗中選用70%甲醇，30%磷酸緩沖溶液(0.01 mol·L-1，pH=3.0)為最合適的流動相.

圖1 NAA紫外吸收光譜圖Fig.1 The ultraviolet absorption spectrum of NAA

圖2 流動相中甲醇含量為45% NAA的色譜圖Fig.2 Chromatogram of NAA when the methanol content is 45% in mobile phase

圖3 流動相中甲醇含量為70% NAA的色譜圖Fig.3 Chromatogram of NAA when the methanol content is 70% in mobile phase

2.2.3 柱溫的選擇 柱溫對物質的分離具有重要的影響，柱溫過高會使分離對象的擴散速度加快，分離時間縮短；柱溫過低，降低擴散速度和分離效能，同時出現峰形變寬等現象[10].實驗中，考察了不同的柱溫對NAA分離的影響，結果表明當柱溫為30 ℃和35 ℃時，峰形較寬，保留時間較長；當柱溫超過40 ℃時，NAA與雜質峰沒有達到基線分離.最后選擇的柱溫是40 ℃.

2.3 NAA檢測方法學的考察

2.3.1 NAA線性范圍與檢出限 配制0.50、1.00、3.75、7.50、15.00和30.00 μg·mL-1的NAA標準溶液，按“1.2.3色譜條件”進行測定，繪制樣品濃度(橫坐標X，μg·mL-1)與峰面積(縱坐標Y，mV·s)標準曲線，進行線性回歸分析，且當信噪比為3(S/N=3)時，該方法對NAA的最低檢出限(LOD)為0.01 μg·mL-1.對30.00 μg·mL-1的NAA溶液進行5次重復實驗，其相對標準偏差(RSD)為2.19%.分析結果如表2所示，結果表明方法在0.50～30.00 μg·mL-1線性范圍內，線性良好，精密度較高.

表2 線性范圍及檢出限Tab.2 The linear range and limit of detection

2.3.2 NAA樣品加標回收率和精密度 本實驗中樣品均來自于實驗室自發的綠豆芽.在綠豆芽的成熟期(8 d)后進行樣品添加回收測定，分別加入1.00、7.50、15.00 μg·mL-1的NAA標準溶液，按照1.2.3所述對樣品進行前處理操作后，進行色譜測定，實驗結果如圖4所示.為了考察方法的精密度，對每一添加濃度樣品重復測定5次.結果表明：NAA的加標回收率在100.2%～110.6%之間，相對標準偏差(RSD)在2.90%～3.89%之間，方法的回收率和重現性均較好.所得結果見表3.

A) 綠豆芽空白樣品；B) 樣品添加15.00 μg·mL-1 NAA標準溶液A) control sample;B) mungbean sprout sample with 15.00 μg·mL-1 NAA圖4 綠豆芽樣品色譜圖Fig.4 Chromatograms of the mungbean sprout samples

表3 方法加標回收率及精密度Tab.3 Standard recovery rate and precision

2.4 樣品中NAA殘留量的分析

在綠豆芽的成熟期(8 d)后按照1.2.3所述進行前處理后，采用建立的分析方法對NAA溶液培養的綠豆芽中的NAA殘留量進行分析，所得結果如表4所示.

從表中可見，培養皿中添加一定濃度的NAA后，綠豆芽中的NAA殘留量均高于空白對照組.但可以看到，在測試的NAA培養液的濃度范圍內(1.9 μg·mL-1及以下)，綠豆芽中的NAA含量不超過0.041 μg·g-1.根據我國《GB2763-2012食品中農藥最大殘留限量》中規定萘乙酸的限量為0.1 mg·kg-1[18]，說明本實驗選取的NAA培養基濃度可安全地用于綠豆芽生產過程而不會導致殘留問題.

表4 綠豆芽中的NAA殘留量Tab.4 Residues of NAA in mungbean sprout

3 結論

本文選用對照培養的方法，比較探究NAA對綠豆芽中Vc的代謝影響，實驗結果表明NAA培養液濃度為1.9×10-1μg·mL-1時，綠豆芽中Vc含量最高，這可為綠豆芽的培養選擇最適濃度的生長調節劑提供一定的指導價值.而且，本研究表明NAA對于綠豆芽生根及發芽具有促進作用，并發現對營養成分如Vc在綠豆芽不同部位分布具有一定的影響.研究探索NAA與內源性生長素如吲哚-3-乙酸的代謝和分布關系，具有一定的科學實用價值，也是將來可能的研究方向.

此外，本文建立了一種分析綠豆芽中NAA殘留的方法，流動相為甲醇和磷酸-氫氧化鈉緩沖溶液(0.01 mol·L-1，pH=3.0)(70∶30，V/V)組成，柱溫為40 ℃，紫外檢測波長220 nm.該方法的線性關系良好，檢出限較低、精密度好、回收率比較理想.所建立的綠豆芽中植物激素殘留的測定方法滿足國家標準對食品中植物激素殘留測定的要求，可提供給相關部門用于對農產品和食品的質量監控.