近紅外熒光探針的合成、表征及應用分析

馮碩

摘? 要：近紅外熒光探針的發射波長能避免生物組織的干擾，對生物成像有較高的效率。文章對鈀檢測、N2H4檢測、苯硫酚檢測作為近紅外熒光探針的合成、表征及具體在細胞中應用的分析。希望能為近紅外熒光探針的更多應用和發展趨勢做出不一樣的分析方向。

關鍵詞：近紅外熒光探針;鈀檢測;N2H4檢測;苯硫酚檢測

中圖分類號：O657.33? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：2095-2945（2020）14-0095-02

Abstract： The emission wavelength of near-infrared fluorescence probe can avoid the interference of biological tissue and has high efficiency for biological imaging. In this paper， palladium detection， N2H4 detection， thiophenol detection as near-infrared fluorescence probe synthesis， characterization and specific application in cells were analyzed. It is hoped that it can make a different analysis method for more applications and development trends of near-infrared fluorescence probes.

Keywords： near-infrared fluorescence probe; palladium detection; N2H4 detection; thiophenol detection

多數熒光探針有著自身限制，具體表現為結構上和形態上的差異，所以大多數的熒光探針的發射波長被限制在了650nm之下，因此不能準確靈敏地去進行細胞內成分檢測，會被樣品的發射波長所干擾。

但近紅外熒光探針在這方面有很好的改進之處，發射波長超過650nm，能夠避免樣本的自發熒光干擾，從而將熒光的化學分析和生物熒光成像做到高靈敏度，所以近紅外熒光探針的應用越來越廣，準確度也越來越高，幫助科研院所更快地取得了眾多的成果研究。

1 近紅外熒光探針的合成、表征

1.1 近紅外熒光探針CyPd的合成、表征

1.1.1 探針CyPd的合成

在對探針CyPd的合成中，要在一個充分安全的環境保護下進行合成的操作，選用較為穩定的零攝氏度和安全氣體氮來作為基礎環境。將Cy化合物與三乙胺共同溶解，并和二氯甲烷溶液混合。再接下來將此混合溶液靜置，把六甲酸稀丙酯滴進此溶液，為保證安全性與實驗效果，需采用注射器的方式逐滴混合攪拌約30分鐘，室溫過夜。最后將此溶液進行減壓蒸發得到固化物，此時的粗產品還需經過硅膠柱提純則可得到探針CyPd，外形為藍色固體。

1.1.2 探針CyPd的表征

在熒光成像分析中，可以看到探針CyPd的溶液顏色在不同的操作下有明顯的變化。比如加入了緩沖溶液后，探針CyPd的熒光成像有明顯的減弱趨勢;在694nm的發射波長下，顏色由紫變藍;發射波長為721nm時的感光強度最強，熒光成像圖中呈現一波高峰。

1.2 近紅外熒光探針DCMC的合成、表征

1.2.1 探針DCMC的合成

探針DCMC的合成依舊要在氮氣保護下進行合成實驗，目的是在探針DCMC的制取中隔絕氧氣，以防止元素在氧氣中產生氧化還原反應，影響實驗的中間產物以致結果的不理想。將DCM的化合物與三乙胺共同溶解，并和二氯甲烷溶液混合。再接下來將此其中反應溫度要控制在零攝氏度后靜置，把乙酰氯溶液滴進此混合溶液，為保證安全性與實驗效果，需采用注射器的方式逐滴混合，約預留出反應時間30分鐘后進行減壓蒸發得到固化物，此時的粗產品還需經過用占比為50份的二氯甲烷比1份的甲醇利用硅膠柱提純法精提純，則可得到探針DCMC，外形為黃色固體。

1.2.2 探針DCMC的表征

在熒光成像分析中，肉眼可見加入了探針DCMC的溶液顏色在不同的操作下有明顯的變化。比如不同濃度的N2H4溶液在加入到探針DCM溶液中，顏色由淡黃變成紫紅;另外根據熒光光譜來看，沒加入N2H4，未顯示有熒光反應和紫外線吸收現象;加入N2H4后，則有很強的熒光反應，借此證明了近紅外熒光探針DCMC對N2H4的檢測效果。

1.3 近紅外熒光探針DCM-CHO-D的合成、表征

1.3.1 探針DCM-CHO-D的合成

探針DCM-CHO-D的合成要在氮氣保護下進行，目的是在探針DCM-CHO-D的制取中防止各個活躍元素在含有氧氣的反應環境中產生化學反應，以致實驗結果的不嚴謹。將探針DCM-CHO-D與三乙胺都按順序加入到二氯甲烷溶液中并使其充分溶解，將反應溫度要控制在零攝氏度后靜置得到溶液一。然后需要制備把2，4-二硝基苯磺酰氯溶于二氯甲烷的混合溶液，得到溶液二，使用注射器把溶液二滴進溶液一中，在零攝氏度的反應溫度下約預留出反應時間10分鐘后，攪拌充分室溫過夜。進行減壓蒸發法得到固化物，此時的粗產品還需經過用到占比為50份的二氯甲烷比1份的甲醇作為洗脫劑，利用色譜硅膠柱提純法精提純，則可得到探針DCM-CHO-D，外形為紅色粉末[1]。

1.3.2 探針DCM-CHO-D的表征

本實驗所選的細胞為HeLa，進行目標細胞的選取后，將其置于96孔板中，期間要注意保證細胞的貼壁，培養時間控制在約24小時。然后用PBS溶液進行洗滌，洗滌次數三次為宜，加入探針DCMC做繼續培養，時間控制在約30分鐘，培養結束再次用PBS溶液進行三次洗滌，繼而在顯微鏡下進行對HeLa細胞的熒光成像分析。接著再加入苯硫酚溶液在培養基中進行細胞孵育約30分鐘，再次用PBS溶液進行三次徹底的洗滌，使培養基中能夠去除殘留的苯硫酚成分。最后用熒光顯微鏡對HeLa細胞熒光成像分析。

檢測苯硫酚使用近紅外熒光探針DCM-CHO-D，在加入了探針DCM-CHO-D后待測苯硫酚溶液顏色在不同的操作下有不同的變化。比如不同濃度的苯硫酚溶液在加入到探針DCM-CHO-D溶液中，顏色由淡黃變成粉紅;另外根據熒光光譜來看，沒加入大劑量的苯硫酚溶液前的緩沖液中，僅顯示有較微弱的熒光反應和紫外線吸收現象;加入N2H4后，則有很強的熒光反應，在一定范圍內苯硫酚的加入與熒光強度呈正相關。

2 近紅外熒光探針的應用分析

2.1 近紅外熒光探針對鈀檢測的應用分析

2.1.1 對鈀檢測的應用機理

鈀檢測是使用探針CyPd來作為近紅外熒光探針的選擇，探針CyPd其中有作為信號作用的CyH、起到識別作用的碳酸烯丙酯，二者的相互配合，將電荷的轉移隔斷，從而起到能夠發射熒光波長和接收并吸收紫外照射的作用。熒光光譜的顯示其實就是反映了待測樣本其中的電荷移動趨勢，當探針CyPd對鈀的檢測中，熒光光譜的波峰有明顯的波動范圍，說明探針CyPd對紫外線的吸收和對熒光的反射有較高的敏感度，進一步證明近紅外熒光探針CyPd能夠對鈀檢測的最終實驗數據做充分的數據保證[2]。

2.1.2 應用于細胞中的檢測

在對選用的HeLa細胞中的檢測，為了防止細胞被損壞，可以進行不對細胞造成損害的細胞成像的影像技術來觀察近紅外熒光探針CyPd對鈀檢測的應用。首先要保持HeLa細胞的活性，不要對細胞膜的通透性產生影響，這樣對鈀的檢測會出現數據偏差。實驗檢測在鈀元素的不同價態下，作為是化合物的PdCl2是危害最大、毒性最強的存在，所以實驗選擇PdCl2作為HeLa細胞成像的關鍵要素。數據顯示，在沒有加入鈀元素化合物前，熒光光譜未顯示有熒光反應，在加入了PdCl2之后，熒光反應強烈。所以證明了近紅外熒光探針CyPd對鈀檢測的實驗中，探針CyPd對鈀元素的檢測及時且準確，而且很好地穿透了細胞膜且并未對細胞活性產生影響。

2.2 近紅外熒光探針對N2H4檢測的應用分析

2.2.1對N2H4檢測的應用機理

探針DCMC對N2H4進行檢測，是因為探針DCMC中含有信號集團和識別基團，分別是由DCM-OH負責發出信號、乙酰基負責識別信號作為對N2H4進行檢測工作原理。近紅外熒光探針DCMC里DCM-OH信號基團被識別基團乙酰基保護在內核部分，做熒光檢測時，由于能夠發出信號的DCM-OH被包含在內部，熒光發出波長但不能與分子內電荷發生反應所以會顯示熒光猝滅;當檢測成分中含有N2H4時，分子內的電荷可以與N2H4發生反應，所以會顯示熒光發射和紫外線吸收的光譜圖，進一步證明近紅外熒光探針DCMC能夠對N2H4檢測[3]。

2.2.2 應用于細胞中的檢測

在進行細胞成像中，可以從實驗的進程里看出，在沒有加入時，熒光光譜圖未顯示有熒光發射，而在加入微量N2H4后，就會有熒光發射和紫外吸收的現象發生。如果繼續加大N2H4的劑量，熒光發射和紫外吸收的現象也會越明顯，這樣的實驗結果有利于后續對人類的生產生活產生持續的重要影響。所以探針DCMC在檢測中和細胞的兼容性很好，而且可以將活細胞中微量的檢測成分N2H4也能清晰地展現出來，說明近紅外熒光探針DCMC在生物活體上面做檢測不會損害細胞活性。

2.3 近紅外熒光探針對苯硫酚檢測的應用分析

2.3.1 對苯硫酚檢測的應用機理

探針DCM-CHO-D對苯硫酚能夠進行檢測是因為探針DCM-CHO-D中是由2，4-二硝基苯磺酸酯負責識別信號、DCM-CHO-OH負責發出信號作為對苯硫酚進行檢測工作原理。探針DCM-CHO-D里DCM-CHO-OH信號基團被2，4-二硝基苯磺酸酯保護，做熒光檢測時被切斷了電荷的移動過程，所以熒光不會被發射;當加入苯硫酚時，苯磺酸酯與苯硫酚發生反應被水解，電荷可以進行轉移引起了熒光發射和紫外線吸收的變化[4]。

2.3.2 應用于細胞中的檢測

在對活細胞的苯硫酚檢測中，對探針DCM-CHO-D進行細胞成像分析，發現加入苯硫酚之后熒光光譜顯示紅色熒光，未加之前細胞并未出現熒光。近紅外熒光探針DCM-CHO-D在苯硫酚檢測中細胞兼容性很好，說明探針DCM-CHO-D在生物活體上很友好，不會損害生物體細胞。

綜上所述，以三類檢測物進行具體分析近紅外熒光探針的合成、表征及應用。探針CyPd可以對鈀檢測做出快速反應，探針DCMC可以將微量的N2H4高靈敏的檢出，探針DCM-CHO-D能在保持細胞活性的基礎上檢測苯硫酚。未來近紅外熒光探針的發展還需要新時代的科研人才去繼續開發創造。

參考文獻：

[1]張逢源，劉曉燕，葉為春.一種近紅外熒光探針的合成、表征及應用[J].分析測試技術與儀器，2019，25（04）：228-231.

[2]于雪，包青青，姜超.花菁類近紅外熒光探針在生物檢測中的應用研究進展[J].化工進展，2019，38（12）：5492-5503.

[3]宋艷，黃文才，齊慶蓉.可用于肼檢測的新型近紅外熒光探針的合成及初步性能研究[J].華西藥學雜志，2019，34（04）：325-331.

[4]蘇偉.幾種近紅外熒光探針的合成表征及其實際應用[D].湖南師范大學，2017.