阿托伐他汀對(duì)顱腦損傷大鼠神經(jīng)元凋亡的抑制作用

唐菁華 孫秀勤 王建軍

顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是一種常見的外傷，主要表現(xiàn)為意識(shí)障礙、頭痛、嘔吐等。研究顯示，TBI 后缺血缺氧、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等可引起一系列繼發(fā)損傷，導(dǎo)致腦缺血、腦梗死甚至死亡[1]。阿托伐他汀具有調(diào)脂、抗氧化、抗炎等藥理學(xué)作用，可以通過血腦屏障，臨床常用于心腦血管疾病的治療[2]。有研究顯示，阿托伐他汀可以改善TBI大鼠的神經(jīng)功能，保護(hù)腦組織損傷[3]，但作用機(jī)制尚不清楚。本研究探討阿托伐他汀對(duì)TBI大鼠神經(jīng)元凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)SD雄性大鼠30只，體重230～260 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2015-0001。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和阿托伐他汀組，各10只。模型組和阿托伐他汀組參照液壓打擊法制作TBI模型，假手術(shù)組僅打開骨窗，不進(jìn)行打擊損傷。

1.2 動(dòng)物造模及給藥 模型組和阿托伐他汀組大鼠參照液壓打擊法制作TBI模型[4]。腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液（2 ml/kg）麻醉，常規(guī)消毒皮膚，于大鼠頭部正中切開頭皮約3 cm，剝離顱骨膜，用磨鉆鉆取直徑約4 mm骨窗。調(diào)節(jié)管口對(duì)準(zhǔn)骨窗，采用液壓腦創(chuàng)傷儀（MODEL01-B，美國(guó) NEW SUN 公司）建立大鼠液壓腦創(chuàng)傷模型，設(shè)置強(qiáng)度為101.3～152.0 kPa。大鼠出現(xiàn)呼吸暫停數(shù)秒、四肢抽搐或小便失禁等，則為造模成功。造模成功后，阿托伐他汀組大鼠立即灌胃阿托伐他汀（1 mg/kg；輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20051408），每天1次；模型組和假手術(shù)組灌胃等量生理鹽水；連續(xù)灌胃2周。

1.3 大鼠神經(jīng)功能評(píng)估 給藥結(jié)束后第2 天，參照Zea Longa 5分制標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。

1.4 取材 神經(jīng)功能評(píng)估結(jié)束后，立即處死大鼠，迅速斷頭取腦，取大鼠腦皮質(zhì)損傷組織，將其分為2份，一份置于4%多聚甲醛中固定，進(jìn)行常規(guī)的脫水、透明、包埋和切片，用于HE和末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）染色；另一份置于-80 ℃保存，用于免疫印跡法檢測(cè)。

1.5 腦組織病灶的病理變化和神經(jīng)元凋亡的觀察 一份切片進(jìn)行HE 染色，光鏡下觀察組織的病理變化，每張切片隨機(jī)取5 個(gè)視野拍照；另一份用于TUNEL染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作染色，在光鏡下觀察，每張切片隨機(jī)取5 個(gè)視野拍照。計(jì)算每個(gè)視野下細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算出比值，則視為細(xì)胞凋亡率。

1.6 血清炎癥因子水平檢測(cè) 采集大鼠股動(dòng)脈血，3 500轉(zhuǎn)/min離心10 min，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清白介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）和IL-1β水平。嚴(yán)格按試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 免疫印跡法檢測(cè)損傷腦組織Toll樣受體4（Toll-like receptor，TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor，NF）-κB p65、p-IκB、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cleaved cysteine aspartic protease，cleaved caspase）-3 表達(dá)水平。取損傷腦皮層組織約50 mg，勻漿，用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液溶解，使用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，取50 μg總蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，用5%脫脂牛奶封閉2 h，采用TBST 洗膜后加入一抗（美國(guó)Santa Cruz 公司）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加二抗（美國(guó)DAKO公司）37 ℃孵育2 h，ECL 顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析；以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿托伐他汀對(duì)TBI 大鼠腦組織損傷和神經(jīng)功能的影響 HE 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病理變化；模型組大鼠腦組織疏松腫脹，神經(jīng)元間隙明顯增大，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；阿托伐他汀組大鼠腦組織損傷程度較模型組明顯改善，見圖1。與假手術(shù)組[（0.24±0.05）分]相比，模型組[（2.67±0.31）分]和阿托伐他汀組[（1.52±0.23）分]神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯下降（P＜0.05）。

2.2 阿托伐他汀對(duì)TBI大鼠神經(jīng)元凋亡的影響 與假手術(shù)組[（14.38±3.62）%]相比，模型組[（48.62±8.58）%]和阿托伐他汀組[（32.76±7.94）%]神經(jīng)元凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率明顯下降（P＜0.05）。

2.3 阿托伐他汀對(duì)TBI 大鼠血清炎癥因子水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組和阿托伐他汀組大鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀組大鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明顯下降（P＜0.05）。見表1。

2.4 阿托伐他汀對(duì)TBI 大鼠損傷腦組織TLR4、NFKB p65、p-IκB、cleaved Caspase-3 表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組和阿托伐他汀組大鼠損傷腦組織TLR4、NF-KB p65、p-IκB、cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀組大鼠損傷腦組織TLR4、NF-KB p65、p-IκB、cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.05）。見圖3、表2。

3 討論

阿托伐他汀是一種親脂性的他汀類藥物，可以通過血腦屏障，具有抗氧化、抗炎、清除自由基等藥理作用，對(duì)于TBI 引起的小鼠腦組織損傷具有保護(hù)作用[6]。楊會(huì)杰等[7]研究顯示，阿托伐他汀可以有效減輕局灶性腦缺血大鼠的腦組織損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。本文結(jié)果顯示阿托伐他汀可顯著改善TBI 大鼠腦組織損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。研究表明，TBI引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)是引起TBI后繼發(fā)性腦組織損傷的主要原因[8]。IL-1β、IL-6 和TNF-α均為活化的單核巨噬細(xì)胞合成并分泌的一種致炎因子，可以誘導(dǎo)多種炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，參與腦組織損傷后的細(xì)胞水腫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等病理過程，在TBI 后繼發(fā)性腦組織損傷中具有重要作用[9]。Chu 等[10]研究表明，TNF-α可以調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 的表達(dá)，激活細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本文結(jié)果顯示阿托伐他汀明顯降低TBI大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平。這提示阿托伐他汀可能通過抑制機(jī)體炎癥因子的釋放，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

圖1 各組大鼠腦組織的病理變化（HE染色）

圖2 阿托伐他汀對(duì)顱腦損傷大鼠神經(jīng)元凋亡的影響（TUNEL染色）

表1 阿托伐他汀對(duì)顱腦損傷大鼠血清炎癥因子水平的影響

表2 阿托伐他汀對(duì)顱腦損傷大鼠損傷腦組織神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 各組大鼠損傷腦組織TLR4、NF-κB p65、p-IκB、cleaved Caspase-3蛋白電泳圖

史曉靜等[11]研究顯示，阿托伐他汀可以抑制NF-κB 炎癥信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡。TLR4 屬于Toll 受體家族，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可以通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)[12]。當(dāng)機(jī)體受到各種生理性或病理性刺激時(shí)，TLR4 可與相應(yīng)的配體結(jié)合，發(fā)生二聚化，激活NF-кB信號(hào)通路[13]。在生理狀況下，NF-кB與IκB結(jié)合處于被抑制轉(zhuǎn)態(tài)，一旦被IκB 激活，發(fā)生磷酸化，可以釋放NF-KB/p65，進(jìn)入胞核與靶序列結(jié)合，促進(jìn)IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[14]。王錦鵬等[15]研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可以下調(diào)TLR4 表達(dá)，抑制MyD88 依賴的NF-κB 信號(hào)通路，抑制炎癥因子TNF-α的釋放。本文結(jié)果顯示阿托伐他汀明顯下調(diào)TBI 大鼠損傷腦組織TLR4、NF-κB p65、p-IκB和cleaved Caspase-3的表達(dá)。這提示阿托伐他汀可能通過調(diào)節(jié)TBI大鼠TLR4/NF-кB信號(hào)通路，抑制炎癥因子的釋放，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

綜上所述，阿托伐他汀可能通過抑制TBI 大鼠的TLR4/NF-кB 信號(hào)通路，抑制炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α等的釋放，抑制神經(jīng)元凋亡，保護(hù)腦組織損傷。